In biologia molecolare, una buona scelta del tampone e la preparazione per diverse fasi di isolamento del DNA possono essere la differenza tra passare all'espressione proteica o aprire un altro kit di maxi-preparazione per iniziare al di sopra di. Nonostante la loro importanza cruciale, le ricette tampone sono spesso proprio questo: ricette scritte senza spiegazioni o motivazioni per i diversi componenti. Un tale tampone è il tampone glucosio-tris-EDTA o GTE.
A cosa serve GTE?
GTE viene utilizzato per risospendere i pellet di cellule batteriche prima della lisi (apertura) delle cellule e della raccolta del DNA plasmidico all'interno. Il lisozima, che ammorbidisce le membrane cellulari, viene spesso aggiunto insieme al tampone GTE. Raggiungere una sospensione omogenea di cellule intere durante questa fase in modo che la soluzione di lisi successivamente aggiunta possa raggiungere tutte le cellule è la chiave per ottenere buone rese di DNA. GTE è progettato per fare questo fornendo anche un ambiente stabile per il DNA.
Glucosio per l'osmolarità
Lo zucchero glucosio 50 mM (millimolare) viene aggiunto al tampone GTE per mantenere l'osmolarità in cui la concentrazione di soluto all'esterno delle cellule è vicina a quella all'interno delle cellule. Ciò impedisce la lisi cellulare prematura, che può causare una minore resa del DNA a causa dell'aggregazione e della degradazione. All'osmolarità della soluzione contribuiscono anche gli altri componenti del tampone, ma il glucosio, essendo un non elettrolita, è una buona scelta perché non interferisce con il tampone della soluzione proprietà.
Tris per la stabilità del pH
Tris è il nome abbreviato di tris (idrossimetil) aminometano, che è un tampone di pH molto comune. Nel caso del tampone GTE, al tampone viene aggiunto il sale acido (Tris-HCl) ad una concentrazione di 25 mM. Ciò mantiene il pH della soluzione a un quasi fisiologico 8.0, un pH ideale per prevenire l'idrolisi acida (degradazione) del DNA plasmidico e reazioni collaterali indesiderate degli altri componenti cellulari.
L'EDTA previene la degradazione del DNA
L'EDTA, o acido etilendiamminotetraacetico, cattura o "chela" gli ioni metallici fuori dalla soluzione, impedendo loro di partecipare a reazioni collaterali indesiderate. Nel tampone GTE, l'EDTA viene aggiunto a 10 mM. Il suo scopo principale è nel buffer per raccogliere zinco, magnesio e calcio liberi, prevenendo così la degradazione del DNA da parte di determinati percorsi che richiedono quei metalli.
Alcuni suggerimenti importanti
Mantieni il tuo tampone GTE freddo e preparalo in piccole quantità per prevenire la crescita di batteri involontari al suo interno. Lo zucchero e il pH controllato lo rendono un ottimo mezzo di crescita. Utilizzare sempre acqua purificata. L'acqua del rubinetto può avere un eccesso di ioni metallici dai tubi, che può sopraffare la capacità dell'EDTA di catturare. Se sospetti la presenza di RNA interferente nel tuo campione, aggiungi RNasi A a 100 microgrammi per millilitro al tuo tampone GTE per eliminare il problema.