I nucleotidi sono gli elementi costitutivi chimici della vita e si trovano nel DNA degli organismi viventi. Ogni nucleotide è costituito da uno zucchero, fosfato e un base azotata: adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G). L'ordine specifico di queste basi nucleotidiche determina quali proteine, enzimi e molecole saranno sintetizzate dalla cellula.
Determinare l'ordine, o la sequenza dei nucleotidi, è importante per lo studio di mutazioni, evoluzione, progressione della malattia, test genetici, indagini forensi e medicina.
Genomica e sequenziamento del DNA
Genomica è lo studio del DNA, dei geni, delle interazioni geniche e delle influenze ambientali sui geni. Il segreto per svelare i complessi meccanismi interni dei geni è essere in grado di identificare la loro struttura e posizione sui cromosomi.
Il progetto degli organismi viventi è determinato dall'ordine (o sequenza) delle coppie di basi dell'acido nucleico nel DNA. Quando il DNA si replica, l'adenina si accoppia con la timina e la citosina con la guanina; vengono considerate le coppie non corrispondenti mutazioni.
Poiché la doppia elica acido desossiribonucleico (DNA) è stata concettualizzata nel 1953, sono stati fatti notevoli miglioramenti nel campo della genomica e del sequenziamento del DNA su larga scala. Gli scienziati stanno lavorando diligentemente per applicare questa nuova conoscenza al trattamento individualizzato delle malattie.
Allo stesso tempo, le discussioni in corso consentono ai ricercatori di stare al passo con le implicazioni etiche di tali tecnologie in rapida esplosione.
Definizione di sequenziamento del DNA
Il sequenziamento del DNA è il processo di scoperta della sequenza di varie basi nucleotidiche in frammenti di DNA. Il sequenziamento dell'intero gene consente il confronto di cromosomi e genomi presenti nella stessa specie e in specie diverse.
La mappatura dei cromosomi è utile per la ricerca scientifica. Analizzando i meccanismi e la struttura di geni, alleli e mutazioni cromosomiche nelle molecole di DNA suggeriscono nuovi modi di trattare i disturbi genetici e fermare la crescita di tumori cancerosi, per esempio.
Sequenziamento del DNA: prime ricerche
I metodi di sequenziamento del DNA di Frederick Sanger notevolmente avanzato il campo della genomica a partire dagli anni '70. Sanger si sentiva pronto ad affrontare il sequenziamento del DNA dopo aver sequenziato con successo l'RNA durante lo studio dell'insulina. Sanger non è stato il primo scienziato a dilettarsi nel sequenziamento del DNA. Tuttavia, i suoi metodi intelligenti di sequenziamento del DNA - sviluppati in tandem con i colleghi Berg e Gilbert - hanno vinto un premio Nobel nel 1980.
La più grande ambizione di Sanger era il sequenziamento di genomi interi su larga scala, ma il sequenziamento di un minuscolo le paia di basi del batteriofago impallidirono rispetto al sequenziamento dei 3 miliardi di paia di basi dell'essere umano genoma. Tuttavia, imparare a sequenziare l'intero genoma di un umile batteriofago è stato un passo importante verso la ricostruzione dell'intero genoma degli esseri umani. Poiché il DNA e i cromosomi sono costituiti da milioni di coppie di basi, la maggior parte dei metodi di sequenziamento separa il DNA in piccoli filamenti, quindi i segmenti di DNA vengono ricomposti; ci vuole solo tempo o macchine veloci e sofisticate.
Nozioni di base sul sequenziamento del DNA
Sanger conosceva il valore potenziale del suo lavoro e spesso collaborava con altri scienziati che condividevano i suoi interessi nel DNA, biologia molecolare e scienze della vita.
Sebbene lenti e costosi rispetto alle odierne tecnologie di sequenziamento, i metodi di sequenziamento del DNA di Sanger erano lodati all'epoca. Dopo tentativi ed errori, Sanger ha trovato la "ricetta" biochimica segreta per separare i filamenti di DNA, creare più DNA e identificare l'ordine dei nucleotidi in un genoma.
I materiali di alta qualità possono essere facilmente acquistati per l'uso in studi di laboratorio:
- DNA polimerasi è l'enzima necessario per produrre il DNA.
- primer del DNA dice all'enzima dove iniziare a lavorare sul filamento di DNA.
- dNTP sono molecole organiche costituite da zucchero desossiribosio e nucleosidi trifosfati – dATP, dGTP, dCTP e dTTP – che assemblano le proteine
- Terminatori di catena sono nucleotidi colorati, chiamati anche nucleotidi terminatore per ciascuna base - A, T, C e G.
Metodi di sequenziamento del DNA: metodi Sanger
Sanger ha scoperto come tagliare il DNA in piccoli segmenti usando l'enzima DNA polimerasi.
Ha quindi ricavato altro DNA da uno stampo e inserito traccianti radioattivi nel nuovo DNA per delimitare le sezioni dei filamenti separati. Riconobbe anche che l'enzima aveva bisogno di un primer che potesse legarsi a un punto specifico sul filamento stampo. Nel 1981, Sanger ha di nuovo fatto la storia scoprendo il genoma delle 16.000 coppie di basi del DNA mitocondriale.
Un altro sviluppo entusiasmante è stato il metodo del fucile a pompa che ha campionato e sequenziato in modo casuale fino a 700 coppie di basi contemporaneamente. Sanger è anche noto per il suo uso del metodo dideoxy (dideoxynucleotide) che inserisce un nucleotide che termina la catena durante la sintesi del DNA per contrassegnare sezioni di DNA per l'analisi. I dideossinucleotidi interrompono l'attività della DNA polimerasi e impediscono ai nucleotidi di accumularsi su una stringa di DNA.
Fasi di sequenziamento del DNA
La temperatura deve essere accuratamente regolata durante tutto il processo di sequenziamento. Innanzitutto, i prodotti chimici vengono aggiunti a un tubo e riscaldati per svelare (denaturare) il doppio filamento molecola di DNA DNA. Quindi la temperatura viene raffreddata, consentendo al primer di aderire.
Successivamente, la temperatura viene aumentata per incoraggiare l'attività ottimale della DNA polimerasi (enzima).
La polimerasi utilizza tipicamente i normali nucleotidi disponibili, che vengono aggiunti a una concentrazione più elevata. Quando la polimerasi arriva a un nucleotide legato al colorante "terminale di catena", la polimerasi si ferma e il la catena finisce lì, il che spiega perché i nucleotidi colorati sono chiamati "terminazione di catena" o "terminatori".
Il processo continua molte, molte volte. Alla fine, il nucleotide legato al colorante è stato posizionato in ogni singola posizione della sequenza del DNA. L'elettroforesi su gel e i programmi per computer possono quindi identificare i colori del colorante su ciascuno dei filamenti di DNA e capire l'intera sequenza del DNA in base al colorante, la posizione del colorante e la lunghezza del fili.
Progressi nella tecnologia di sequenziamento del DNA
Sequenziamento ad alto rendimento – generalmente indicato come sequenziamento di nuova generazione – utilizza nuovi progressi e tecnologie per sequenziare le basi nucleotidiche in modo più rapido ed economico che mai. Una macchina per il sequenziamento del DNA può facilmente gestire tratti di DNA su larga scala. In effetti, l'intero genoma può essere realizzato in poche ore, invece di anni con le tecniche di sequenziamento di Sanger.
I metodi di sequenziamento di nuova generazione possono gestire l'analisi del DNA ad alto volume senza la fase aggiuntiva di amplificazione o clonazione per ottenere abbastanza DNA per il sequenziamento. Le macchine per il sequenziamento del DNA eseguono più reazioni di sequenziamento contemporaneamente, il che è più economico e veloce.
In sostanza, la nuova tecnologia di sequenziamento del DNA esegue centinaia di reazioni di Sanger su un piccolo microchip facilmente leggibile che viene quindi eseguito tramite un programma per computer che assembla la sequenza.
La tecnica legge frammenti di DNA più brevi, ma è ancora più veloce ed efficiente dei metodi di sequenziamento di Sanger, quindi anche i progetti su larga scala possono essere completati rapidamente.
Il Progetto Genoma Umano
Il Progetto Genoma Umano, completato nel 2003, è uno dei più famosi studi di sequenziamento fatti fino ad oggi. Secondo un articolo del 2018 in Notizie scientifiche, il genoma umano consiste di circa 46.831 geni, che è stata una sfida formidabile per la sequenza. I migliori scienziati di tutto il mondo hanno trascorso quasi 10 anni collaborando e consultando. Guidato dal National Human Genome Research
Institute, il progetto è riuscito a mappare il genoma umano utilizzando un campione composito prelevato da donatori di sangue anonimi.
Il progetto sul genoma umano si è basato su metodi di sequenziamento dei cromosomi artificiali batterici (basati su BAC) per mappare le coppie di basi. La tecnica utilizzava batteri per clonare frammenti di DNA, ottenendo grandi quantità di DNA per il sequenziamento. I cloni sono stati quindi ridotti di dimensioni, posti in una macchina per il sequenziamento e assemblati in tratti che rappresentano il DNA umano.
Altri esempi di sequenziamento del DNA
Le nuove scoperte nel campo della genomica stanno cambiando profondamente gli approcci alla prevenzione, all'individuazione e al trattamento delle malattie. Il governo ha impegnato miliardi di dollari per la ricerca sul DNA. Le forze dell'ordine si affidano all'analisi del DNA per risolvere i casi. I kit per il test del DNA possono essere acquistati per uso domestico per ricercare gli antenati e identificare varianti genetiche che possono comportare rischi per la salute:
- Analisi genomica comporta il confronto e il contrasto delle sequenze del genoma di molte specie diverse nei domini e nei regni della vita. Il sequenziamento del DNA può rivelare modelli genetici che gettano nuova luce su determinate sequenze introdotte evolutivamente. L'ascendenza e la migrazione possono essere rintracciate tramite l'analisi del DNA e confrontate con i documenti storici.
- I progressi della medicina stanno accadendo a un ritmo esponenziale perché praticamente ogni malattia umana ha una componente genetica. Il sequenziamento del DNA aiuta scienziati e medici a capire come più geni interagiscono tra loro e con l'ambiente. Il sequenziamento rapido del DNA di un nuovo microbo che causa un'epidemia può aiutare a identificare farmaci e vaccini efficaci prima che il problema diventi un serio problema di salute pubblica. Le varianti geniche nelle cellule cancerose e nei tumori potrebbero essere sequenziate e utilizzate per sviluppare terapie geniche personalizzate.
- La scienza forense le applicazioni sono state utilizzate per aiutare le forze dell'ordine a risolvere migliaia di casi difficili dalla fine degli anni '80, secondo il Istituto Nazionale di Giustizia. Le prove sulla scena del crimine possono contenere campioni di DNA da ossa, capelli o tessuto corporeo che possono essere confrontati con il profilo del DNA di un sospetto per aiutare a determinare la colpevolezza o l'innocenza. La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo comunemente usato per fare copie di DNA da tracce prima del sequenziamento.
- Sequenziamento di specie appena scoperte può aiutare a identificare quali altre specie sono più strettamente correlate e rivelare informazioni sull'evoluzione. I tassonomisti usano i "codici a barre" del DNA per classificare gli organismi. Secondo il Università della Georgia nel maggio 2018, ci sono circa 303 specie di mammiferi ancora da scoprire.
- Test genetici per le malattie cercare varianti genetiche mutate. La maggior parte sono polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), il che significa che solo un nucleotide nella sequenza viene modificato dalla versione "normale". I fattori ambientali e lo stile di vita influiscono su come e se determinati geni vengono espressi. Le aziende globali mettono a disposizione dei ricercatori di tutto il mondo tecnologie di sequenziamento all'avanguardia di nuova generazione interessate alle interazioni multigeniche e al sequenziamento dell'intero genoma.
- Kit DNA genealogico utilizzare sequenze di DNA nel loro database per verificare la presenza di varianti nei geni di un individuo. Il kit richiede un campione di saliva o un tampone sulla guancia che viene inviato per posta a un laboratorio commerciale per l'analisi. Oltre alle informazioni sull'ascendenza, alcuni kit possono identificare polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) o altro varianti genetiche ben note come i geni BRCA1 e BRCA2 associati a un rischio elevato per il seno femminile e cancro ovarico.
Implicazioni etiche del sequenziamento del DNA
Le nuove tecnologie spesso comportano la possibilità di benefici sociali, oltre che di danni; esempi includono centrali nucleari malfunzionanti e armi nucleari di distruzione di massa. Anche le tecnologie del DNA comportano dei rischi.
Le preoccupazioni emotive sul sequenziamento del DNA e sugli strumenti di modifica genetica come CRISPR includono i timori che il la tecnologia potrebbe facilitare la clonazione umana o portare a animali transgenici mutanti creati da un ladro scienziato.
Più spesso, le questioni etiche relative al sequenziamento del DNA hanno a che fare con il consenso informato. Un facile accesso al test del DNA diretto al consumatore significa che i consumatori potrebbero non comprendere appieno come verranno utilizzate, archiviate e condivise le loro informazioni genetiche. I profani potrebbero non essere emotivamente pronti a conoscere le loro varianti genetiche difettose e i rischi per la salute.
Terze parti come i datori di lavoro e le compagnie di assicurazione potrebbero potenzialmente discriminare gli individui portatori di geni difettosi che possono dar luogo a gravi problemi medici.