La clonazione molecolare è un metodo biotecnologico comune con cui ogni studente e ricercatore dovrebbe avere familiarità. Clonazione molecolare utilizzando un tipo di enzima chiamato enzima di restrizione per tagliare il DNA umano in frammenti che possono poi essere inseriti nel DNA plasmidico di una cellula batterica. Gli enzimi di restrizione tagliano a metà il DNA a doppio filamento. A seconda dell'enzima di restrizione, il taglio può provocare un'estremità appiccicosa o un'estremità smussata. Le estremità adesive sono più utili nella clonazione molecolare perché assicurano che il frammento di DNA umano sia inserito nel plasmide nella giusta direzione. Il processo di legatura, o fusione di frammenti di DNA, richiede meno DNA quando il DNA ha estremità appiccicose. Infine, più enzimi di restrizione appiccicosi possono produrre la stessa estremità appiccicosa, anche se ogni enzima riconosce una sequenza di restrizione diversa. Ciò aumenta la probabilità che la regione di interesse del DNA possa essere tagliata da enzimi appiccicosi.
Enzimi di restrizione e siti di restrizione
Gli enzimi di restrizione sono enzimi che tagliano riconoscono sequenze specifiche sul DNA a doppio filamento e tagliano il DNA a metà in quella sequenza. La sequenza riconosciuta è chiamata sito di restrizione. Gli enzimi di restrizione sono chiamati endonucleasi perché tagliano il DNA a doppio filamento, che è il modo in cui normalmente esiste il DNA, in posizioni che si trovano tra le estremità del DNA. Esistono più di 90 diversi enzimi di restrizione. Ciascuno riconosce un sito di restrizione distinto. Gli enzimi di restrizione scindono i rispettivi siti di restrizione 5.000 volte più efficientemente di altri siti che non riconoscono.
Il giusto orientamento
Gli enzimi di restrizione si dividono in due classi generali. Tagliano il DNA in estremità appiccicose o estremità smussate. Un'estremità appiccicosa ha una breve regione di nucleotidi, gli elementi costitutivi del DNA, che non è accoppiata. Questa regione non accoppiata è chiamata sporgenza. Si dice che la sporgenza sia appiccicosa perché vuole e si accoppierà con un'altra estremità adesiva che ha una sequenza di sporgenza complementare. Le estremità appiccicose sono come gemelli perduti che cercano di abbracciarsi forte una volta incontrati. D'altra parte, le estremità smussate non sono appiccicose perché tutti i nucleotidi sono già accoppiati tra i due filamenti di DNA. Il vantaggio delle estremità adesive è che un frammento di DNA umano può inserirsi in un plasmide batterico solo in una direzione. Al contrario, se sia il DNA umano che il plasmide batterico hanno estremità smussate, il DNA umano può essere inserito testa a coda o coda a testa nel plasmide.
La legatura delle estremità adesive richiede meno DNA
Sebbene il DNA con estremità a bastoncino abbia più facilità a trovarsi a causa della loro "viscosità", né le estremità appiccicose né le estremità smussate possono fondersi insieme in un pezzo continuo di DNA. La formazione di un pezzo continuo di DNA completamente collegato richiede un enzima chiamato ligasi. Le ligasi collegano le spine dorsali dei nucleotidi alle estremità appiccicose o smussate, risultando in una catena continua di nucleotidi. Poiché le estremità appiccicose si trovano più velocemente a causa della loro attrazione reciproca, il processo di legatura richiede meno DNA umano e meno DNA plasmidico. Le estremità smussate del DNA e dei plasmidi hanno meno probabilità di trovarsi l'una con l'altra, e quindi la legatura delle estremità smussate richiede che nella provetta venga inserito più DNA.
Enzimi diversi possono dare la stessa estremità appiccicosa
I siti di restrizione si trovano in tutto il genoma degli organismi, ma non sono equidistanti. Nei plasmidi, possono essere progettati per essere posizionati uno accanto all'altro. Gli scienziati che vogliono ritagliare un frammento di DNA umano dal genoma umano devono trovare siti di restrizione che si trovano davanti e dietro la regione del frammento. Oltre a garantire che un frammento di DNA sia inserito nella giusta direzione, diversi enzimi appiccicosi possono creare la stessa estremità adesiva anche se riconoscono diverse sequenze di restrizione. Ad esempio, BamHI, BglII e Sau3A hanno sequenze di riconoscimento diverse ma producono la stessa estremità adesiva GATC. Ciò aumenta la probabilità che ci siano siti di restrizione terminali appiccicosi che fiancheggiano il tuo gene umano di interesse.