Gli svantaggi del Western Blotting

Il western blotting è una delle procedure più comuni nei laboratori biochimici. Fondamentalmente, separa le proteine ​​da un campione in base alle dimensioni, quindi esegue il test utilizzando anticorpi per determinare se è presente una determinata proteina. È utile non solo nella ricerca ma anche nei laboratori medici o diagnostici; i test sia per l'HIV che per la malattia di Lyme, ad esempio, comportano un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), seguito da un Western blot se l'ELISA risulta positivo. Nonostante la sua popolarità, tuttavia, il Western blot presenta diversi svantaggi.

I classici Western blot non sono quantitativi. In altre parole, mentre possono dire ai ricercatori se è presente una particolare proteina, non consentono di quantificare la quantità di proteina presente. Alcune aziende biotecnologiche ora vendono kit che consentono ai ricercatori o ai tecnici di laboratorio di quantificare la quantità di proteina presente utilizzando una curva standard, ma funziona solo se sono presenti campioni puri della stessa proteina a disposizione. Inoltre, il peso molecolare di una proteina può essere stimato solo con Western blotting, piuttosto che determinato con precisione come con la spettrometria di massa.

Un Western blot può essere eseguito solo se sono disponibili anticorpi primari contro la proteina di interesse. Sebbene gli anticorpi per molte proteine ​​diverse siano disponibili presso le aziende biotecnologiche, non sono economici; se gli anticorpi primari non sono disponibili per una data proteina, non sarà possibile eseguire un Western blot alla ricerca di quella particolare proteina. Inoltre, i ricercatori potrebbero voler determinare se una proteina è stata modificata in qualche modo, se è stata fosforilata (ha avuto un gruppo fosfato ad esso collegato), per esempio - e con la tecnica Western blot hanno bisogno di anticorpi specifici per il modificato proteina.

Può essere difficile eseguire correttamente un Western blot e ottenere buoni risultati, quindi il personale deve essere ben addestrato. In questo come in molto altro l'esperienza è forse il miglior tutore; anche per un tecnico esperto, tuttavia, un Western blot richiede molto tempo. La parte dell'esperimento relativa all'elettroforesi su gel, ad esempio, richiede in genere da una a due ore per essere eseguita. Altre attività possono essere eseguite mentre il gel è in funzione, ovviamente, ma l'esperimento richiede ancora un po' di tempo per ottenere risultati.

Gli anticorpi possono a volte mostrare un legame fuori bersaglio, che può portare a risultati peggiori. Inoltre, con il Western blotting, usi un anticorpo contro una proteina specifica, quindi i tuoi risultati ti diranno solo se quella proteina era presente. La spettrometria di massa ad alta risoluzione, al contrario, rivela tutte le proteine ​​presenti in un campione e, a differenza del classico Western blotting, è quantitativa. È importante ricordare, ovviamente, che la spettrometria di massa è molto più costosa e anche tecnicamente più difficile da usare rispetto al Western blotting.