Quando si lavora con la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), una buona calibrazione è assolutamente essenziale per garantire risultati affidabili e di qualità. La corretta calibrazione di uno strumento HPLC inizia con la creazione di uno standard di calibrazione adatto. Nella maggior parte dei casi, infatti, la calibrazione richiede una serie di standard a concentrazione crescente per produrre quella che è nota come curva di calibrazione. Questa è una linea tracciata e un'equazione associata che descrive la relazione tra la concentrazione della sostanza chimica in esame e la risposta del rivelatore HPLC.
Determinare la sostanza chimica che si desidera testare utilizzando l'HPLC (l'"analita"). Ad esempio, potresti voler testare una serie di bevande analcoliche per il contenuto di fruttosio, nel qual caso il fruttosio sarebbe l'analita.
Ottenere una quantità della sostanza chimica analita di purezza adeguata. Normalmente la purezza dovrebbe essere superiore al 99% e l'analita dovrebbe essere acquistato da una rispettabile azienda di fornitura di prodotti chimici. Nel caso del fruttosio, ad esempio, acquisteresti fruttosio puro da un venditore di prodotti chimici e non da un negozio di alimentari.
Determinare le concentrazioni massime e minime previste dell'analita nei campioni che si intende testare sull'HPLC. Nel caso delle bevande analcoliche, esaminerai le etichette delle bevande e determinerai il contenuto di fruttosio più basso e più alto tra le bevande che testerai. Tieni presente che il campione iniziale (la bevanda analcolica) può essere diluito o altrimenti manipolato durante la preparazione per l'analisi (a seconda del metodo HPLC utilizzato) e quindi la concentrazione dell'analita nei campioni effettivamente iniettati sull'HPLC può essere modificata. È la concentrazione dell'analita nei campioni come eseguiti sull'HPLC che deve essere considerata.
Determina il solvente in cui dissolverai l'analita per creare gli standard di calibrazione. Questo solvente deve essere in grado di dissolvere correttamente l'analita in un intervallo di concentrazione relativamente ampio (almeno pari a quello dei campioni che si intende testare). Inoltre, questo solvente dovrebbe idealmente essere abbastanza simile alla "fase mobile": il solvente utilizzato per trasportare i campioni attraverso lo strumento HPLC.
Calcolare la quantità di analita necessaria per creare una soluzione "standard stock" dell'analita. Questo si trova moltiplicando la concentrazione richiesta dello standard stock per il volume desiderato. La concentrazione dell'analita in questa soluzione deve essere almeno del 10% superiore alla concentrazione massima prevista del campione. Se la massima concentrazione di fruttosio prevista in un campione di bibita è di 8 grammi/100 millilitri, lo standard di scorta potrebbe essere portato a una concentrazione di 10 grammi di fruttosio/100 millilitri. Un volume ragionevole è 500 millilitri, quindi sarebbero necessari 8/100 mL x 500 mL = 40 grammi di fruttosio.
Pesare la quantità richiesta di analita con un livello di precisione adeguato. Spesso è adatto un valore di peso in grammi preciso a una o due posizioni decimali, ma per alcuni metodi potrebbe essere necessaria una maggiore precisione.
Trasferire l'analita pesato in un matraccio tarato del volume necessario e aggiungere il solvente desiderato fino al segno di riempimento sul pallone. L'uso di un matraccio tarato (piuttosto che un bicchiere graduato, ad esempio) aumenta la precisione del valore di concentrazione dello standard stock. Assicurarsi che tutto l'analita sia trasferito nel pallone; utilizzare parte del solvente per lavarlo, se necessario.
Effettuare una serie di diluizioni variabili dello standard stock trasferendo volumi noti dello standard stock in matracci tarati, utilizzando pipette per un trasferimento accurato, quindi aggiungendo solvente. La concentrazione standard più bassa deve essere inferiore al campione minimo previsto da analizzare. Nell'esempio della bevanda analcolica, se la concentrazione minima di fruttosio prevista in un campione è 2 grammi/100 mL, è possibile creare uno standard da 1 grammo/100 mL. Ciò verrebbe ottenuto da una diluizione dieci volte superiore dello standard azionario. La serie standard dovrebbe includere un totale di 5 o 6 concentrazioni, quindi sarebbero necessarie diluizioni aggiuntive per produrre standard di forse 3, 5 e 8 grammi di fruttosio/mL. Ora hai una serie di soluzioni standard con cui calibrare l'HPLC.