L'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) è un metodo biochimico per identificare le proteine in soluzione. Come illustrato da Mathews et al in "Biochimica", i campioni di proteine vengono prima caricati in "pozzetti" o fori su un'estremità del blocco di gel di poliacrilammide. Un campo elettrico viene quindi applicato al gel. SDS, aggiunto ai campioni caricati, nega la carica naturale delle proteine. Per questo motivo, il solo peso molecolare delle proteine determina la velocità di migrazione delle proteine mentre si muovono attraverso il gel verso il polo caricato positivamente, osserva Bitesize Bio. Più proteine nello stesso campione, quindi, si separeranno l'una dall'altra e migreranno in posizioni diverse.
Orienta la fotografia del gel. "Top" è la posizione dei pozzetti in cui sono stati originariamente aggiunti i campioni. "Bottom" è dove i campioni sono migrati verso e più spesso contiene il fronte del colorante che indica il fronte di migrazione dei campioni. Sia la sinistra che la destra dovrebbero contenere un "marcatore", usato come guida prevedibile del peso molecolare.
Etichetta i campioni per ogni corsia. Nella parte superiore, i campioni aggiunti ai pozzetti saranno migrati verticalmente in "corsie". Pertanto, tutte le barre visibili in una colonna verticale provenivano dall'unico campione caricato direttamente sopra di essa. Usa il righello e la penna per mettere i bordi sulle corsie se è difficile visualizzare le colonne.
Etichetta le dimensioni molecolari delle bande nella corsia dei marcatori. I marcatori disponibili in commercio sono dotati di un'immagine del modello di banda da aspettarsi insieme ai pesi molecolari di ciascuna banda. Le bande sono le "barre" orizzontali scure, che in realtà sono proteine colorate incorporate nel gel.
Disegna linee orizzontali chiare che si estendono da ciascuna banda di pennarello fino al bordo opposto del gel. Fare attenzione a rendere queste linee parallele ai pozzetti e al fronte del colorante. Queste linee indicano dove si troverebbero le proteine del peso molecolare indicato da ciascuna delle bande marker in ciascuna corsia. Ad esempio, una banda nella corsia 4 che risiede appena sotto la linea estesa dai 25 kilodalton la banda del marker suggerirebbe che la banda della corsia 4 è quasi ma non del tutto 25 kilodalton in molecolare peso.
Etichetta ogni banda in ogni corsia con il suo peso molecolare stimato. Usa i marker come guida e stima i valori tra le dimensioni dei marker.
Sotto la fotografia del gel, fai un elenco di "proteine" per ogni corsia. Inizia affermando ciò che è noto su ciascun campione, come la sua origine o le condizioni. Quindi elencare il peso molecolare stimato di ciascuna banda nella corsia. Le corsie con una banda indicano che il campione contiene solo una proteina. Le corsie con più bande indicano la presenza di più proteine. Le bande che corrono con il fronte di migrazione sono più piccole di quelle suggerite dal marker più vicino e probabilmente non possono essere previste se non come "più piccole di" indicato dal marker.
Nell'elenco delle proteine, annotare le stranezze. Un aspetto "sbavato" può indicare che sono presenti troppe proteine o che la viscosità del campione ha influito sulla sua migrazione Se le bande sembrano andare oltre il bordo della corsia o sono piuttosto grandi rispetto ad altre bande, allora la concentrazione di quella proteina è probabilmente troppo alta e dovrebbe essere diluita in futuro elettroforesi. Una tinta grigiastra in tutta la corsia, più scura del colore del gel di fondo, indica frammenti proteici indistinguibili.
Determinare l'identità delle proteine in ciascuna corsia. Sebbene ciò venga fatto utilizzando solo il peso molecolare, la fonte di ciascuna corsia probabilmente indicherà anche degli indizi. Considera che in alcune condizioni, le proteine possono mantenere un'associazione di dimeri o trimeri su un gel. Pertanto, una proteina può apparire su un gel come tre bande distinte. Anche se le proteine non possono essere identificate, la relativa oscurità delle bande può implicare le concentrazioni delle proteine in soluzione. Eventuali proteine curiose e sconosciute possono essere isolate direttamente dal gel originale e inviate per l'identificazione.
Cose di cui avrai bisogno
- Fotografia del gel SDS-PAGE, colorato
- Chiave per marcatore di peso molecolare utilizzato
- Righello
- Penna