Componenti di base di un HPLC

La cromatografia liquida ad alte prestazioni è una tecnica per l'analisi di laboratorio di una miscela. È un tipo efficiente di cromatografia che utilizza l'alta pressione, piuttosto che la semplice gravità, per spingere un campione di una miscela attraverso una colonna. Viene iniettato un campione, quindi una pompa contenente elevate quantità di pressione aiuta a spostare il campione lungo una colonna impaccata, dove viene separato nei singoli componenti. Questa separazione viene quindi analizzata da un rivelatore per ottenere risultati.

Per essere iniettato in un HPLC, un campione deve prima essere sciolto in un solvente liquido polare, preferibilmente uno con spettri HPLC noti, in modo che i suoi dati possano essere distinti da quelli del campione. La soluzione liquida contenente il campione viene posta nello strumento e inviata nella colonna. La posizione effettiva del sito di iniezione dipende dalla marca degli strumenti. Nella maggior parte dei casi, il processo di iniezione è automatizzato, ma in alcuni casi un operatore di laboratorio deve iniettare il campione utilizzando un piccolo ago di siringa.

Il componente della pompa dell'unità HPLC è necessario perché fornisce la pressione che spinge il campione attraverso la colonna. La forza della pompa varia, ma una potente può produrre una pressione fino a 6.000 psi, o libbre per pollice quadrato, che viene applicata dopo l'iniezione del campione. Ciò consente al campione di passare attraverso la colonna in modo più rapido ed efficiente che se dovesse gocciolare utilizzando solo la forza di gravità.

La maggiore velocità di un campione fatto passare attraverso la colonna da una pompa consente l'uso di un diverso tipo di colonna rispetto a quelli utilizzati nella semplice cromatografia liquida. Il materiale di riempimento nella colonna può avere una dimensione delle particelle molto più piccola, che aumenta l'area superficiale e quindi favorisce le interazioni del campione con la colonna. La maggior parte delle colonne HPLC funziona attraverso la polarità. Il campione viene sciolto in un solvente polare e la colonna è costituita in gran parte da idrocarburi non polari. Le parti polari della molecola del campione passano molto rapidamente attraverso la colonna perché interagiscono principalmente con il solvente, mentre i componenti non polari del campione indugiano nella colonna, formando interazioni deboli con la colonna componenti. Pertanto, i componenti del campione escono dalla colonna in ordine dal più polare al più non polare.

I rilevatori variano anche in base al tipo di strumento HPLC utilizzato. Tuttavia, la maggior parte funziona nello stesso modo di base. Una sorgente di luce ultravioletta illumina i componenti del campione separati mentre escono dalla colonna. La maggior parte dei composti organici assorbe una certa quantità di luce, quindi quando passano accanto al raggio di luce applicato, un rilevatore può rilevare la quantità di luce assorbita. Il rilevatore registra anche il tempo di ritenzione dei componenti in base all'ordine in cui escono dalla colonna. Questo output può quindi essere analizzato in base all'area del picco per determinare l'esatta natura dei componenti del campione.