Kloning DNA: Pengertian, Proses, Contoh

Ada kemungkinan untuk mengkloning seluruh organisme seperti domba Dolly, tetapi kloning DNA berbeda. Ini menggunakan teknik biologi molekuler untuk membuat salinan identik dari sekuens DNA atau gen tunggal.

Menggunakan metode rekayasa genetika, segmen kode genetik DNA diidentifikasi dan diisolasi. Kloning DNA kemudian menyalin asam nukleat urutan dalam segmen.

Salinan identik yang dihasilkan dapat digunakan untuk penelitian lebih lanjut atau untuk aplikasi bioteknologi. Seringkali gen yang disalin mengkodekan protein yang dapat menjadi bagian dari perawatan medis. Teknologi DNA termasuk Kloning DNA mendukung pemahaman tentang bagaimana gen bekerja dan bagaimana kode genetik manusia mempengaruhi fungsi tubuh.

Kloning DNA adalah proses biologi molekuler untuk membuat salinan identik dari segmen DNA yang terletak di kromosom yang mengandung kode genetik organisme tingkat lanjut.

Proses tersebut menghasilkan sejumlah besar sekuens DNA target. Tujuan dari kloning DNA adalah untuk menghasilkan sekuens DNA target itu sendiri atau untuk menghasilkan protein yang dikodekan dalam sekuens target.

Dua metode yang digunakan dalam kloning DNA disebut vektor plasmid dan reaksi berantai polimerase (PCR). Dalam vektor plasmid metode, untai DNA dipotong menggunakan enzim restriksi untuk menghasilkan fragmen DNA, dan segmen yang dihasilkan dimasukkan ke dalam vektor kloning yang disebut plasmid untuk duplikasi lebih lanjut. Plasmid ditempatkan dalam sel bakteri yang kemudian menghasilkan salinan DNA atau protein yang disandikan.

Dalam metode PCR, segmen untai DNA yang akan diduplikasi ditandai dengan enzim yang disebut primer. Enzim polimerase membuat salinan bagian yang ditandai dari untai DNA. Metode ini tidak menggunakan enzim restriksi dan dapat menghasilkan DNA kloning dari sampel kecil. Kadang-kadang dua metode teknologi DNA digunakan bersama untuk menggabungkan fitur terbaik dari masing-masing dalam reaksi keseluruhan.

Vektor metode mengacu pada plasmid yang digunakan untuk menahan segmen DNA target yang akan dikloning. Plasmid adalah untaian melingkar kecil dari DNA non-kromosom ditemukan di banyak organisme termasuk bakteri dan virus.

Plasmid bakteri adalah vektor yang digunakan untuk memasukkan segmen DNA target ke dalam sel bakteri untuk duplikasi lebih lanjut.

Memilih dan mengisolasi DNA target: Sebelum proses kloning DNA dapat dimulai, urutan DNA harus diidentifikasi, terutama bagian awal dan akhir segmen DNA.

Urutan DNA tersebut dapat ditemukan dengan menggunakan DNA kloning yang ada dengan urutan yang diketahui atau dengan mempelajari protein yang dihasilkan oleh urutan DNA target. Setelah urutan diketahui, enzim restriksi yang sesuai dapat digunakan.

Pemotongan DNA target dengan enzim restriksi: Enzim restriksi dipilih untuk mencari kode DNA pada awal dan akhir sekuens target.

Ketika enzim restriksi menemukan urutan pasangan basa berkode khusus yang disebut situs restriksi, mereka menempelkan diri ke DNA di lokasi itu dan melilitkan diri di sekitar molekul DNA, memutuskan untai. Segmen DNA yang dipotong berisi urutan target sekarang tersedia untuk duplikasi.

Memilih vektor plasmid dan memasukkan DNA target: Plasmid yang cocok idealnya mengandung urutan pengkodean DNA yang sama dengan untai DNA dari mana DNA target dipotong. Untai DNA sirkular dari plasmid dipotong dengan enzim restriksi yang sama seperti yang digunakan untuk memotong DNA target.

SEBUAH Enzim DNA ligase digunakan untuk mempromosikan tautan segmen DNA, dan ujung segmen DNA target terhubung dengan ujung potongan DNA plasmid. DNA target sekarang membentuk bagian dari untai DNA plasmid sirkular.

Memasukkan plasmid ke dalam sel bakteri: Setelah plasmid berisi urutan DNA yang akan dikloning, kloning yang sebenarnya dapat dilakukan dengan menggunakan proses yang disebut transformasi bakteri. Plasmid dimasukkan ke dalam sel bakteri seperti E.coli. coli, dan sel-sel dengan segmen DNA baru akan mulai memproduksi salinan dan protein yang sesuai.

Dalam transformasi bakteri, sel inang dan plasmid diinkubasi bersama pada suhu tubuh selama sekitar 12 jam. Sel-sel menyerap beberapa plasmid dan memperlakukan mereka sebagai DNA plasmid mereka sendiri.

Memanen DNA dan protein kloning: Kebanyakan plasmid yang digunakan untuk kloning DNA memiliki gen resistensi antibiotik tergabung dalam DNA mereka. Saat sel bakteri menyerap plasmid baru, mereka menjadi resisten terhadap antibiotik.

Ketika kultur diobati dengan antibiotik, hanya sel-sel yang telah menyerap plasmid baru yang bertahan. Hasilnya adalah kultur murni sel bakteri dengan DNA kloning. DNA itu kemudian dapat dipanen atau protein yang sesuai dapat diproduksi.

Itu PCR metode ini lebih sederhana dan menyalin DNA yang ada di tempatnya. Tidak memerlukan pemotongan dengan enzim restriksi atau penyisipan plasmidDNA urutan. Ini membuatnya sangat cocok untuk mengkloning sampel DNA dengan jumlah untai DNA yang terbatas. Meskipun metode ini dapat mengkloning DNA, itu tidak dapat digunakan untuk produksi protein yang sesuai.

Uncoiling untai DNA: DNA dalam kromosom tergulung rapat dalam struktur heliks ganda. Memanaskan DNA hingga 96 derajat Celcius dalam proses yang disebut denaturasi membuat molekul DNA terurai dan terpisah menjadi dua untai. Pemisahan ini diperlukan karena hanya satu untai DNA yang dapat dikloning pada satu waktu.

Memilih primer: Seperti halnya kloning DNA vektor plasmid, urutan DNA yang akan dikloning harus diidentifikasi dengan penekanan khusus pada awal dan akhir segmen DNA. Primer adalah enzim yang menempel pada urutan kode DNA tertentu, dan mereka harus dipilih untuk menandai segmen DNA target. Primer yang tepat akan menempel pada urutan molekul DNA untuk menandai awal dan akhir segmen target.

Annealing reaksi untuk mengikat primer: Mendinginkan reaksi hingga sekitar 55 derajat Celcius disebut anil. Saat reaksi mendingin, primer diaktifkan dan menempel pada untai DNA di setiap ujung segmen DNA target. Primer hanya bertindak sebagai penanda, dan untai DNA tidak harus dipotong.

Memproduksi salinan identik dari segmen DNA target: Dalam proses yang disebut perpanjangan, enzim TAQ polimerase peka panas ditambahkan ke reaksi. Reaksi kemudian dipanaskan hingga 72 derajat Celcius, mengaktifkan enzim. Enzim DNA polimerase aktif mengikat primer dan menyalin urutan DNA di antara mereka. Proses sekuensing DNA dan kloning awal selesai.

Meningkatkan hasil kloning DNA: Proses anil dan ekstensi awal membuat salinan segmen untai DNA yang tersedia relatif sedikit. Untuk meningkatkan hasil melalui replikasi DNA tambahan, reaksi didinginkan lagi untuk mengaktifkan kembali primer dan membiarkan mereka mengikat untai DNA lainnya.

Kemudian, pemanasan ulang reaksi mengaktifkan enzim polimerase lagi dan lebih banyak salinan diproduksi. Siklus ini dapat diulang 25 sampai 30 kali.

Metode vektor plasmid bergantung pada pasokan awal DNA yang cukup untuk dipotong dan dimasukkan ke dalam plasmid. Terlalu sedikit DNA asli menghasilkan lebih sedikit plasmid dan awal yang lambat untuk produksi DNA kloning.

Metode PCR dapat menghasilkan sejumlah besar DNA dari beberapa untai DNA asli, tetapi karena DNA tidak ditanamkan dalam sel bakteri, produksi protein tidak mungkin dilakukan.

Untuk menghasilkan protein yang dikodekan dalam fragmen DNA yang akan diklon dari sampel DNA awal yang kecil, kedua metode tersebut dapat digunakan bersama-sama, dan keduanya dapat saling memuji. Pertama metode PCR digunakan untuk mengkloning DNA dari sampel kecil dan menghasilkan banyak salinan.

Kemudian produk PCR tersebut digunakan dengan metode vektor plasmid untuk menanamkan DNA yang dihasilkan ke dalam sel bakteri yang akan menghasilkan protein yang diinginkan.

Biologi molekuler menggunakan kloning gen dan replikasi DNA untuk tujuan medis dan komersial. Bakteri dengan urutan DNA kloning digunakan untuk memproduksi obat-obatan dan menggantikan zat yang tidak dapat diproduksi sendiri oleh orang dengan kelainan genetik.

Penggunaan yang umum meliputi:

• Gen untuk insulin manusia dikloning pada bakteri yang kemudian menghasilkan insulin yang digunakan oleh penderita diabetes.
• Aktivator plasminogen jaringan diproduksi dari DNA kloning dan digunakan untuk membantu mencegah pembekuan darah.
• Hormon pertumbuhan manusia dapat diproduksi dan diberikan kepada orang yang tidak dapat memproduksinya sendiri.

Bioteknologi juga menggunakan kloning gen di bidang pertanian untuk menciptakan karakteristik baru pada tumbuhan dan hewan atau meningkatkan karakteristik yang ada. Karena lebih banyak gen yang dikloning, jumlah kemungkinan penggunaan meningkat secara eksponensial.

Molekul DNA membentuk sebagian kecil materi dalam sel hidup, dan sulit untuk mengisolasi pengaruh dari banyak gen. Metode kloning DNA memberikan sejumlah besar urutan DNA spesifik untuk dipelajari, dan DNA memproduksi protein seperti yang terjadi pada sel aslinya. Kloning DNA memungkinkan untuk mempelajari operasi ini untuk gen yang berbeda secara terpisah.

Aplikasi penelitian dan teknologi DNA yang khas meliputi pemeriksaan:

• Fungsi suatu gen.
• Mutasi suatu gen.
• Ekspresi gen.
• Produk gen.
• Cacat genetik.

Ketika lebih banyak sekuens DNA dikloning, lebih mudah untuk menemukan dan mengkloning sekuens tambahan. Segmen DNA kloning yang ada dapat digunakan untuk menentukan apakah segmen baru cocok dengan yang lama dan bagian mana yang berbeda. Mengidentifikasi urutan DNA target kemudian lebih cepat dan lebih akurat.

Di terapi gen, gen kloning disajikan ke sel-sel organisme yang gen alaminya rusak. Gen vital yang menghasilkan protein yang diperlukan untuk fungsi organisme tertentu dapat bermutasi, diubah oleh radiasi atau dipengaruhi oleh virus.

Ketika gen tidak bekerja dengan baik, zat penting hilang dari sel. Terapi gen mencoba untuk ganti gen dengan versi kloning yang akan menghasilkan zat yang dibutuhkan.

Terapi gen masih eksperimental, dan beberapa pasien telah disembuhkan dengan menggunakan teknik ini. Masalahnya terletak pada identifikasi gen tunggal yang bertanggung jawab atas kondisi medis dan pengiriman banyak salinan gen ke sel yang tepat. Karena kloning DNA telah menjadi lebih luas, terapi gen telah diterapkan dalam beberapa situasi tertentu.

Aplikasi yang berhasil baru-baru ini termasuk:

• Penyakit Parkinson: Menggunakan virus sebagai vektor, gen terkait penyakit Parkinson disuntikkan ke otak tengah pasien. Pasien mengalami peningkatan keterampilan motorik tanpa efek samping yang merugikan.
• Defisiensi adenosin deaminase (ADA): Gangguan kekebalan genetik diobati dengan membuang sel induk darah pasien dan memasukkan gen ADA. Pasien mampu menghasilkan setidaknya beberapa ADA mereka sendiri sebagai hasilnya.
• hemofilia: Orang dengan hemofilia tidak menghasilkan protein spesifik yang membantu pembekuan darah. Sebuah gen untuk produksi salah satu protein yang hilang dimasukkan ke dalam sel-sel hati pasien. Pasien menghasilkan protein dan insiden perdarahan berkurang.

Terapi gen adalah salah satu aplikasi kloning DNA yang paling menjanjikan, tetapi penggunaan baru lainnya kemungkinan akan berkembang biak karena lebih banyak urutan DNA dipelajari dan fungsinya ditentukan. Kloning DNA memberikan bahan mentah untuk rekayasa genetika dalam jumlah yang dibutuhkan.

Ketika peran gen diketahui dan fungsinya yang tepat dapat dipastikan melalui penggantian yang rusak gen, banyak penyakit kronis dan bahkan kanker dapat diserang dan diobati pada tingkat genetik menggunakan DNA teknologi.

Konten terkait:

• Karakteristik Koloni E.Coli (Escherichia Coli)
• RNA: Definisi, Fungsi, Struktur