Peran GTE dalam Ekstraksi DNA

Dalam biologi molekuler, pilihan dan persiapan buffer yang baik untuk langkah-langkah isolasi DNA yang berbeda dapat perbedaan antara beralih ke ekspresi protein atau membuka kit persiapan maksimal lainnya untuk memulai lebih. Terlepas dari kepentingan krusialnya, resep buffer seringkali hanya itu-resep yang ditulis tanpa penjelasan atau alasan untuk komponen yang berbeda. Salah satu buffer tersebut adalah buffer glukosa-tris-EDTA atau GTE.

GTE digunakan untuk meresuspensi pelet sel bakteri sebelum melisiskan (membuka) sel dan memanen DNA plasmid di dalamnya. Lisozim, yang melembutkan membran sel, sering ditambahkan bersama dengan buffer GTE. Mencapai suspensi homogen dari seluruh sel selama langkah ini sehingga larutan lisis yang ditambahkan selanjutnya dapat mencapai semua sel adalah kunci untuk mendapatkan hasil DNA yang baik. GTE dirancang untuk melakukan ini sambil juga menyediakan lingkungan yang stabil untuk DNA.

Gula glukosa 50mM (milimolar) ditambahkan ke buffer GTE untuk mempertahankan osmolaritas di mana konsentrasi zat terlarut di luar sel mendekati konsentrasi zat terlarut di dalam sel. Ini mencegah lisis sel prematur, yang dapat menyebabkan hasil DNA yang lebih rendah karena agregasi dan degradasi. Komponen lain dari buffer juga berkontribusi terhadap osmolaritas larutan, tetapi glukosa, menjadi non-elektrolit, adalah pilihan yang baik karena tidak mengganggu buffer larutan properti.

Tris adalah nama pendek untuk tris (hidroksimetil) aminometana, yang merupakan buffer pH yang sangat umum. Dalam kasus buffer GTE, garam asam (Tris-HCl) ditambahkan ke buffer pada konsentrasi 25mM. Hal ini mempertahankan pH larutan pada mendekati fisiologis 8,0, pH ideal untuk mencegah hidrolisis asam (degradasi) DNA plasmid dan reaksi samping yang tidak diinginkan dari komponen sel lainnya.

EDTA, atau asam etilendiamintetraasetat, menangkap atau "mengkhelat" ion logam dari larutan, mencegahnya berpartisipasi dalam reaksi samping yang tidak diinginkan. Dalam buffer GTE, EDTA ditambahkan pada 10mM. Tujuan utamanya adalah dalam buffer untuk mengumpulkan seng, magnesium, dan kalsium bebas, sehingga mencegah degradasi DNA oleh jalur tertentu yang membutuhkan logam tersebut.

Jaga agar buffer GTE Anda tetap dingin dan buat dalam jumlah kecil untuk mencegah pertumbuhan bakteri yang tidak diinginkan di dalamnya. Gula dan pH yang terkontrol merupakan media pertumbuhan yang bagus. Selalu gunakan air murni. Air keran dapat memiliki kelebihan ion logam dari pipa, yang dapat membebani kemampuan EDTA untuk menangkap. Jika Anda mencurigai adanya gangguan RNA dalam sampel Anda, tambahkan RNase A pada 100 mikrogram per mililiter ke buffer GTE Anda untuk menghilangkan masalah.