Pengurutan DNA: Definisi, Metode, Contoh

Nukleotida adalah blok bangunan kimia kehidupan dan ditemukan dalam DNA organisme hidup. Setiap nukleotida terdiri dari sebuah gula, fosfat dan basa yang mengandung nitrogen: adenin (A), timin (T), sitosin (C) dan guanin (G). Urutan spesifik basa nukleotida ini menentukan protein, enzim, dan molekul mana yang akan disintesis oleh sel.

Menentukan urutan, atau urutan nukleotida, penting untuk mempelajari mutasi, evolusi, perkembangan penyakit, pengujian genetik, penyelidikan forensik dan kedokteran.

genomik adalah studi tentang DNA, gen, interaksi gen dan pengaruh lingkungan pada gen. Rahasia untuk mengungkap cara kerja gen yang kompleks adalah mampu mengidentifikasi struktur dan lokasinya pada kromosom.

Cetak biru organisme hidup ditentukan oleh urutan (atau urutan) pasangan asam nukleat basa dalam DNA. Ketika DNA bereplikasi, adenin berpasangan dengan timin, dan sitosin dengan guanin; pasangan yang tidak cocok dianggap mutasi.

Sejak heliks ganda asam deoksiribonukleat

Pada saat yang sama, diskusi yang sedang berlangsung memungkinkan para peneliti untuk tetap berada di depan implikasi etis dari teknologi yang meledak dengan cepat tersebut.

Sekuensing DNA adalah proses menemukan urutan berbagai basa nukleotida dalam potongan DNA. Sekuensing seluruh gen memungkinkan perbandingan kromosom dan genom yang ada dalam spesies yang sama dan berbeda.

Memetakan kromosom berguna untuk penelitian ilmiah. Menganalisis mekanisme dan struktur dari gen, alel dan mutasi kromosom dalam molekul DNA menyarankan cara baru untuk mengobati kelainan genetik dan menghentikan pertumbuhan tumor kanker, misalnya.

Metode pengurutan DNA Frederick Sanger sangat maju bidang genomik mulai tahun 1970-an. Sanger merasa siap untuk menangani sekuensing DNA setelah berhasil mengurutkan RNA saat mempelajari insulin. Sanger bukanlah ilmuwan pertama yang mencoba-coba pengurutan DNA. Namun, metode pengurutan DNA-nya yang cerdas – dikembangkan bersama dengan rekan kerja Berg dan Gilbert – mendapatkan Hadiah Nobel pada 1980.

Sanger mengetahui nilai potensial dari karyanya dan sering berkolaborasi dengan ilmuwan lain yang memiliki minat yang sama dalam DNA, biologi molekuler dan ilmu kehidupan.

Meskipun lambat dan mahal dibandingkan dengan teknologi pengurutan saat ini, metode pengurutan DNA Sanger dipuji pada saat itu. Setelah coba-coba, Sanger menemukan "resep" biokimia rahasia untuk memisahkan untaian DNA, menciptakan lebih banyak DNA dan mengidentifikasi urutan nukleotida dalam genom.

Bahan berkualitas tinggi dapat dengan mudah dibeli untuk digunakan dalam penelitian laboratorium:

• DNA polimerase adalah enzim yang dibutuhkan untuk membuat DNA.
• primer DNA memberitahu enzim di mana untuk mulai bekerja pada untai DNA.
• dNTP adalah molekul organik yang terdiri dari gula deoksiribosa dan nukleosida trifosfat - dATP, dGTP, dCTP dan dTTP – yang merakit protein
• Terminator rantai adalah nukleotida berwarna pewarna, juga disebut nukleotida terminator untuk setiap basa – A, T, C dan G.

Sanger menemukan cara untuk memotong DNA menjadi segmen-segmen kecil menggunakan enzim DNA polimerase.

Dia kemudian membuat lebih banyak DNA dari templat dan memasukkan pelacak radioaktif ke dalam DNA baru untuk membatasi bagian dari untaian yang terpisah. Dia juga menyadari bahwa enzim membutuhkan primer yang dapat mengikat ke tempat tertentu pada untai cetakan. Pada tahun 1981, Sanger kembali membuat sejarah dengan menemukan genom dari 16.000 pasangan basa DNA mitokondria.

Suhu harus disesuaikan dengan hati-hati selama proses pengurutan. Pertama, bahan kimia ditambahkan ke tabung dan dipanaskan untuk mengurai (denaturasi) untai ganda double molekul DNA. Kemudian suhu didinginkan, memungkinkan primer untuk mengikat.

Selanjutnya, suhu dinaikkan untuk mendorong aktivitas DNA polimerase (enzim) yang optimal.

Polimerase biasanya menggunakan nukleotida normal yang tersedia, yang ditambahkan pada konsentrasi yang lebih tinggi. Ketika polimerase mencapai nukleotida terkait-pewarna “pengakhiran rantai”, polimerase berhenti, dan rantai berakhir di sana, yang menjelaskan mengapa nukleotida yang diwarnai disebut "pengakhiran rantai" atau "terminator."

Prosesnya berlanjut berkali-kali. Akhirnya, nukleotida terkait-pewarna telah ditempatkan pada setiap posisi tunggal dari urutan DNA. Elektroforesis gel dan program komputer kemudian dapat mengidentifikasi warna pewarna pada masing-masing untai DNA dan mengetahui seluruh urutan DNA berdasarkan pewarna, posisi pewarna dan panjang untaian.

Urutan throughput tinggi – umumnya disebut sebagai pengurutan generasi berikutnya – menggunakan kemajuan dan teknologi baru untuk mengurutkan basa nukleotida lebih cepat dan lebih murah daripada sebelumnya. Mesin pengurutan DNA dapat dengan mudah menangani bentangan DNA skala besar. Faktanya, seluruh genom dapat dilakukan dalam hitungan jam, bukan bertahun-tahun dengan teknik pengurutan Sanger.

Metode sekuensing generasi berikutnya dapat menangani analisis DNA volume tinggi tanpa langkah amplifikasi atau kloning tambahan untuk mendapatkan DNA yang cukup untuk pengurutan. Mesin pengurutan DNA menjalankan beberapa reaksi pengurutan sekaligus, yang lebih murah dan lebih cepat.

Pada dasarnya, teknologi pengurutan DNA yang baru menjalankan ratusan reaksi Sanger pada mikrochip kecil yang mudah dibaca yang kemudian dijalankan melalui program komputer yang merakit rangkaian tersebut.

Teknik ini membaca fragmen DNA yang lebih pendek, tetapi masih lebih cepat dan lebih efisien daripada metode pengurutan Sanger, sehingga proyek skala besar pun dapat diselesaikan dengan cepat.

Itu Proyek Genom Manusia, yang diselesaikan pada tahun 2003, adalah salah satu studi pengurutan paling terkenal yang dilakukan hingga saat ini. Menurut artikel 2018 di Berita Sains, genom manusia terdiri dari kira-kira 46.831 gen, yang merupakan tantangan berat untuk urutan. Ilmuwan top dari seluruh dunia menghabiskan hampir 10 tahun untuk berkolaborasi dan berkonsultasi. Dipimpin oleh Riset Genom Manusia Nasional

Institute, proyek tersebut berhasil memetakan genom manusia menggunakan sampel komposit yang diambil dari donor darah anonim.

Proyek Genom Manusia mengandalkan metode sekuensing kromosom buatan bakteri (berbasis BAC) untuk memetakan pasangan basa. Teknik ini menggunakan bakteri untuk mengkloning fragmen DNA, menghasilkan DNA dalam jumlah besar untuk diurutkan. Klon-klon itu kemudian diperkecil ukurannya, ditempatkan di mesin pengurutan dan dirangkai menjadi bentangan yang mewakili DNA manusia.

Penemuan baru dalam genomik sangat mengubah pendekatan untuk pencegahan, deteksi, dan pengobatan penyakit. Pemerintah telah berkomitmen miliaran dolar untuk penelitian DNA. Penegakan hukum mengandalkan analisis DNA untuk menyelesaikan kasus. Kit pengujian DNA dapat dibeli untuk digunakan di rumah guna meneliti leluhur dan mengidentifikasi varian gen yang dapat menimbulkan risiko kesehatan:

• Analisis genom memerlukan membandingkan dan membedakan urutan genom dari banyak spesies yang berbeda dalam domain dan kerajaan kehidupan. Sekuensing DNA dapat mengungkapkan pola genetik yang menjelaskan kapan sekuens tertentu diperkenalkan secara evolusioner. Keturunan dan migrasi dapat dilacak melalui analisis DNA dan dibandingkan dengan catatan sejarah.

• Kemajuan dalam kedokteran terjadi pada tingkat eksponensial karena hampir setiap penyakit manusia memiliki komponen genetik. Pengurutan DNA membantu para ilmuwan dan dokter memahami bagaimana banyak gen berinteraksi satu sama lain dan lingkungan. Mengurutkan DNA mikroba baru yang menyebabkan wabah penyakit dengan cepat dapat membantu mengidentifikasi obat-obatan dan vaksin yang efektif sebelum masalah tersebut menjadi masalah kesehatan masyarakat yang serius. Varian gen dalam sel kanker dan tumor dapat diurutkan dan digunakan untuk mengembangkan terapi gen individual.

• Ilmu forensik aplikasi telah digunakan untuk membantu penegakan hukum memecahkan ribuan kasus sulit sejak akhir 1980-an, menurut Institut Kehakiman Nasional. Bukti TKP mungkin berisi sampel DNA dari tulang, rambut atau jaringan tubuh yang dapat dibandingkan dengan profil DNA tersangka untuk membantu menentukan bersalah atau tidak. Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah metode yang umum digunakan untuk membuat salinan DNA dari bukti jejak sebelum pengurutan.

• Mengurutkan spesies yang baru ditemukan dapat membantu mengidentifikasi spesies lain yang paling dekat hubungannya dan mengungkapkan informasi tentang evolusi. Ahli taksonomi menggunakan DNA "barcode" untuk mengklasifikasikan organisme. Menurut Universitas Georgia Pada Mei 2018, diperkirakan ada 303 spesies mamalia yang belum ditemukan.

• Tes genetik untuk penyakit mencari varian gen yang bermutasi. Sebagian besar adalah polimorfisme nukleotida tunggal (SNP), yang berarti hanya satu nukleotida dalam urutan yang diubah dari versi "normal". Faktor lingkungan dan gaya hidup mempengaruhi bagaimana dan jika gen tertentu diekspresikan. Perusahaan global membuat teknologi pengurutan generasi baru yang mutakhir tersedia bagi para peneliti di seluruh dunia yang tertarik pada interaksi multigen dan pengurutan seluruh genom.

• Kit DNA silsilah menggunakan urutan DNA dalam database mereka untuk memeriksa varian dalam gen individu. Kit ini membutuhkan sampel air liur atau usap pipi yang dikirim ke laboratorium komersial untuk dianalisis. Selain informasi leluhur, beberapa kit dapat mengidentifikasi polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) atau varian genetik terkenal seperti gen BRCA1 dan BRCA2 yang terkait dengan peningkatan risiko payudara wanita dan kanker ovarium.

Teknologi baru sering kali datang dengan kemungkinan manfaat sosial, serta bahaya; contohnya termasuk pembangkit listrik tenaga nuklir yang tidak berfungsi dan senjata nuklir pemusnah massal. Teknologi DNA juga memiliki risiko.

Kekhawatiran emosional tentang pengurutan DNA dan alat pengeditan gen seperti CRISPR mencakup ketakutan bahwa: teknologi mungkin memfasilitasi kloning manusia, atau mengarah pada hewan transgenik mutan yang diciptakan oleh bajingan ilmuwan.

Lebih sering, masalah etika yang berkaitan dengan pengurutan DNA harus dilakukan dengan persetujuan. Akses mudah ke pengujian DNA langsung ke konsumen berarti konsumen mungkin tidak sepenuhnya memahami bagaimana informasi genetik mereka akan digunakan, disimpan, dan dibagikan. Orang awam mungkin tidak siap secara emosional untuk mempelajari varian gen yang rusak dan risiko kesehatannya.

Pihak ketiga seperti majikan dan perusahaan asuransi berpotensi mendiskriminasi individu yang membawa gen cacat yang dapat menimbulkan masalah medis yang serius.