Keuntungan Menggunakan Enzim Ujung Lengket

Kloning molekuler adalah metode bioteknologi umum yang harus diketahui oleh setiap siswa dan peneliti. Kloning molekuler menggunakan sejenis enzim yang disebut enzim restriksi untuk memotong DNA manusia menjadi fragmen-fragmen yang kemudian dapat dimasukkan ke dalam DNA plasmid sel bakteri. Enzim restriksi memotong DNA untai ganda menjadi dua. Tergantung pada enzim restriksi, potongan dapat menghasilkan ujung yang lengket atau ujung yang tumpul. Ujung lengket lebih berguna dalam kloning molekuler karena memastikan bahwa fragmen DNA manusia dimasukkan ke dalam plasmid dengan arah yang benar. Proses ligasi, atau penggabungan fragmen DNA, membutuhkan lebih sedikit DNA ketika DNA memiliki ujung yang lengket. Terakhir, beberapa enzim restriksi ujung lengket dapat menghasilkan ujung lengket yang sama, meskipun setiap enzim mengenali urutan restriksi yang berbeda. Ini meningkatkan kemungkinan bahwa wilayah DNA yang Anda minati dapat dipotong oleh enzim ujung yang lengket.

Enzim restriksi adalah enzim yang memotong mengenali urutan spesifik pada DNA beruntai ganda dan memotong DNA menjadi dua pada urutan itu. Urutan yang dikenali disebut situs restriksi. Enzim restriksi disebut endonuklease karena mereka memotong DNA untai ganda, yang merupakan cara DNA biasanya ada, di lokasi yang berada di antara ujung DNA. Ada lebih dari 90 enzim restriksi yang berbeda. Masing-masing mengenali situs pembatasan yang berbeda. Enzim restriksi membelah situs restriksi masing-masing 5.000 kali lebih efisien daripada situs lain yang tidak mereka kenali.

Enzim restriksi datang dalam dua kelas umum. Mereka memotong DNA menjadi ujung yang lengket atau ujung yang tumpul. Ujung lengket memiliki wilayah pendek nukleotida, blok pembangun DNA, yang tidak berpasangan. Wilayah yang tidak berpasangan ini disebut overhang. Overhang dikatakan lengket karena ingin dan akan berpasangan dengan ujung lengket lain yang memiliki urutan overhang komplementer. Ujung yang lengket seperti anak kembar yang telah lama hilang yang ingin saling berpelukan erat begitu mereka bertemu. Di sisi lain, ujung tumpul tidak lengket karena semua nukleotida sudah dipasangkan di antara dua untai DNA. Keuntungan dari ujung lengket adalah bahwa fragmen DNA manusia hanya dapat masuk ke dalam plasmid bakteri dalam satu arah. Sebaliknya, jika DNA manusia dan plasmid bakteri memiliki ujung yang tumpul, DNA manusia dapat disisipkan secara head-to-tail atau tail-to-head ke dalam plasmid.

Meskipun DNA dengan ujung stik lebih mudah menemukan satu sama lain karena “kelengketannya”, baik ujung lengket maupun ujung tumpul tidak dapat menyatu menjadi potongan DNA yang berkesinambungan. Pembentukan potongan DNA yang berkesinambungan yang benar-benar terkait membutuhkan enzim yang disebut ligase. Ligase menghubungkan tulang punggung nukleotida pada ujung yang lengket atau tumpul, menghasilkan rantai nukleotida yang berkesinambungan. Karena ujung lengket menemukan satu sama lain lebih cepat karena daya tariknya satu sama lain, proses ligasi membutuhkan lebih sedikit DNA manusia dan lebih sedikit DNA plasmid. Ujung tumpul DNA dan plasmid cenderung tidak saling menemukan, dan dengan demikian ligasi ujung tumpul mengharuskan lebih banyak DNA dimasukkan ke dalam tabung reaksi.

Situs pembatasan terletak di seluruh genom organisme, tetapi tidak berjarak sama. Dalam plasmid, mereka dapat direkayasa untuk ditempatkan tepat di sebelah satu sama lain. Para ilmuwan yang ingin memotong sebuah fragmen DNA manusia dari genom manusia harus menemukan situs restriksi yang berada di depan dan di belakang wilayah fragmen tersebut. Selain memastikan bahwa fragmen DNA dimasukkan ke arah yang benar, enzim ujung lengket yang berbeda dapat membuat ujung lengket yang sama meskipun mereka mengenali urutan restriksi yang berbeda. Misalnya, BamHI, BglII, dan Sau3A memiliki urutan pengenalan yang berbeda tetapi menghasilkan ujung lengket GATC yang sama. Ini meningkatkan kemungkinan bahwa akan ada situs pembatasan ujung lengket yang mengapit gen manusia yang Anda minati.