Kekurangan Western Blotting

Western blotting adalah salah satu prosedur paling umum di laboratorium biokimia. Pada dasarnya, ini memisahkan protein dari sampel berdasarkan ukuran, kemudian menguji menggunakan antibodi untuk menentukan apakah ada protein tertentu. Ini berguna tidak hanya dalam penelitian tetapi juga di laboratorium medis atau diagnostik; tes untuk HIV dan penyakit Lyme, misalnya, melibatkan tes enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), diikuti dengan Western blot jika tes ELISA positif. Namun, terlepas dari popularitasnya, Western blotting memiliki beberapa kelemahan.

Western blot klasik tidak kuantitatif. Dengan kata lain, sementara mereka dapat memberi tahu peneliti apakah ada protein tertentu, mereka tidak memungkinkan untuk mengukur berapa banyak protein yang ada. Beberapa perusahaan biotek sekarang menjual kit yang memungkinkan peneliti atau teknisi laboratorium untuk menghitung jumlah protein yang ada menggunakan kurva standar -- tetapi ini hanya berfungsi jika sampel murni dari protein yang sama adalah tersedia. Selain itu, berat molekul protein hanya dapat diperkirakan dengan Western blotting, daripada ditentukan secara tepat seperti dengan spektrometri massa.

Western blot hanya dapat dilakukan jika antibodi primer terhadap protein yang diinginkan tersedia. Sementara antibodi untuk banyak protein berbeda tersedia dari perusahaan biotek, mereka tidak murah; jika antibodi primer tidak tersedia untuk protein tertentu, tidak mungkin dilakukan Western blot untuk mencari protein tertentu. Selain itu, peneliti mungkin ingin menentukan apakah suatu protein telah dimodifikasi dengan cara tertentu -- jika protein tersebut telah terfosforilasi (memiliki a gugus fosfat yang melekat padanya), misalnya -- dan dengan teknik Western blot mereka memerlukan antibodi khusus untuk senyawa yang dimodifikasi protein.

Mungkin sulit untuk melakukan Western blot dengan benar dan mendapatkan hasil yang baik, jadi staf harus terlatih dengan baik. Dalam hal ini seperti dalam banyak hal lainnya, pengalaman mungkin adalah tutor terbaik; bahkan untuk teknisi yang berpengalaman, bagaimanapun, noda Barat memakan waktu. Bagian elektroforesis gel dari percobaan, misalnya, biasanya akan memakan waktu satu hingga dua jam untuk dijalankan. Tugas lain dapat dilakukan saat gel sedang berjalan, tentu saja, tetapi percobaan masih membutuhkan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil.

Antibodi terkadang menunjukkan beberapa pengikatan di luar target, yang dapat menghasilkan hasil yang lebih buruk. Selain itu, dengan Western blotting, Anda menggunakan antibodi terhadap protein tertentu, sehingga hasil Anda hanya akan memberi tahu Anda jika protein itu ada. Spektrometri massa resolusi tinggi, sebaliknya, mengungkapkan semua protein yang ada dalam sampel, dan tidak seperti blotting Barat klasik, itu adalah kuantitatif. Penting untuk diingat, tentu saja, bahwa spektrometri massa jauh lebih mahal dan juga lebih menantang secara teknis untuk digunakan dibandingkan dengan Western blotting.