Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) adalah metode biokimia untuk mengidentifikasi protein dalam larutan. Seperti yang diilustrasikan oleh Mathews et al dalam "Biokimia," sampel protein pertama kali dimasukkan ke dalam "sumur" atau lubang di salah satu ujung blok gel poliakrilamida. Medan listrik kemudian diterapkan pada gel. SDS, ditambahkan ke sampel yang dimuat, meniadakan muatan alami protein. Untuk alasan ini, berat molekul protein saja yang menentukan kecepatan migrasi protein saat mereka bergerak melalui gel menuju kutub bermuatan positif, catat Bitesize Bio. Oleh karena itu, beberapa protein dalam sampel yang sama akan terpisah satu sama lain dan bermigrasi ke posisi yang berbeda.
Arahkan foto gel. "Atas" adalah lokasi sumur tempat sampel awalnya ditambahkan. "Bawah" adalah tempat sampel bermigrasi dan paling sering berisi bagian depan pewarna yang menunjukkan bagian depan sampel yang bermigrasi. Baik kiri atau kanan harus berisi "penanda", yang digunakan sebagai panduan berat molekul yang dapat diprediksi.
Beri label sampel untuk setiap jalur. Di bagian atas, sampel yang ditambahkan ke sumur akan bermigrasi secara vertikal di "jalur". Oleh karena itu, semua batang yang terlihat dalam kolom vertikal berasal dari satu sampel yang dimuat langsung di atasnya. Gunakan penggaris dan pena untuk menempatkan batas pada jalur jika sulit untuk memvisualisasikan kolom.
Beri label ukuran molekul pita di jalur penanda. Penanda yang tersedia secara komersial dilengkapi dengan gambar pola pita yang diharapkan bersama dengan berat molekul masing-masing pita. Pita adalah "batang" horizontal gelap, yang sebenarnya adalah protein bernoda yang tertanam di dalam gel.
Gambar garis horizontal tipis yang memanjang dari setiap pita penanda ke tepi gel yang berlawanan. Hati-hati untuk membuat garis-garis ini sejajar dengan sumur dan bagian depan pewarna. Garis-garis ini menunjukkan di mana protein dengan berat molekul yang ditunjukkan oleh masing-masing pita penanda akan ditempatkan di setiap jalur. Misalnya, band di jalur 4 yang berada tepat di bawah garis diperpanjang dari 25 kilodalton pita penanda akan menunjukkan bahwa pita jalur 4 hampir tetapi tidak cukup 25 kilodalton dalam molekul bobot.
Beri label setiap pita di setiap jalur dengan perkiraan berat molekulnya. Gunakan penanda sebagai panduan, dan perkirakan nilai di antara ukuran penanda.
Di bawah foto gel, buat daftar "protein" untuk setiap jalur. Mulailah dengan menyatakan apa yang diketahui tentang setiap sampel, seperti asal atau kondisinya. Kemudian buat daftar perkiraan berat molekul masing-masing pita di jalur. Jalur dengan satu pita menunjukkan bahwa sampel hanya mengandung satu protein. Jalur dengan banyak pita menunjukkan adanya beberapa protein. Pita yang berjalan dengan bagian depan migrasi lebih kecil dari yang disarankan oleh penanda terdekat dan kemungkinan tidak dapat diprediksi kecuali sebagai "lebih kecil dari" yang ditunjukkan oleh penanda.
Dalam daftar protein, perhatikan keanehan. Penampakan yang "tercoreng" dapat menunjukkan bahwa terdapat terlalu banyak protein atau bahwa kekentalan sampel mempengaruhi migrasinya. tepi jalur atau cukup besar dibandingkan dengan pita lain, maka konsentrasi protein itu kemungkinan terlalu tinggi dan harus diencerkan di masa depan elektroforesis. Warna keabu-abuan di seluruh jalur, lebih gelap dari warna gel latar belakang, menunjukkan fragmen protein yang tidak dapat dibedakan.
Tentukan identitas protein di setiap jalur. Meskipun ini dilakukan hanya dengan menggunakan berat molekul, sumber setiap jalur kemungkinan akan menunjukkan petunjuk juga. Pertimbangkan bahwa dalam beberapa kondisi, protein dapat mempertahankan asosiasi dimer atau trimer pada gel. Oleh karena itu, satu protein dapat muncul pada gel sebagai tiga pita yang berbeda. Bahkan jika protein tidak dapat diidentifikasi, kegelapan relatif pita dapat menyiratkan konsentrasi protein dalam larutan. Setiap protein yang ingin tahu dan tidak diketahui dapat diisolasi langsung dari gel asli dan dikirim untuk identifikasi.
Hal yang Anda Butuhkan
- Foto gel SDS-PAGE, diwarnai
- Kunci untuk penanda berat molekul yang digunakan
- Penggaris
- Pena