Mi az első lépés a polimeráz láncreakcióban?

A polimeráz láncreakció vagy PCR olyan technika, amely a DNS egyik fragmentumát sok - exponenciálisan sok - fragmensre fénymásolja. Az első lépés a PCR-ben az, hogy a DNS-t úgy melegítsük fel, hogy az denaturáljon vagy egyes szálakká olvadjon. A DNS szerkezete olyan, mint egy kötéllétra, amelyben a lépcsők mágneses végű kötelek. A mágnesek összekapcsolódva alkotják a fokokat, úgynevezett alappárokat, és így ellenállnak a széthúzásnak. A DNS minden töredéke különféle hőmérsékleteken egyetlen szálakká olvad. Annak megértése, hogy a DNS szerkezetét hogyan tartják össze a DNS egyes részei, bepillantást enged a miértekbe a különböző DNS-fragmensek megolvadnak különböző hőmérsékleteken, és miért van szükség ilyen magas hőmérsékletekre az elsőben hely.

A PCR első lépése a DNS megolvasztása, hogy a kettős szálú DNS egyszálú DNS-vé váljon szét. Az emlős DNS esetében ez az első lépés általában körülbelül 95 Celsius fok (kb. 200 Fahrenheit) hővel jár. Ezen a hőmérsékleten a hidrogénkötések az A-T és a G-C bázispárok, vagy a DNS-létra lépcsői között szétesnek, kibontva a kettős szálú DNS-t. A hőmérséklet azonban nem elég meleg ahhoz, hogy megtörje a foszfát-cukor gerincet, amely az egyes szálakat vagy a létra oszlopait alkotja. Az egyes szálak teljes elválasztása felkészíti őket a PCR második lépésére, amely lehűl, lehetővé téve, hogy a rövid DNS-fragmensek, az úgynevezett primerek megkötjék az egyes szálakat.

Az egyik oka annak, hogy a DNS-t 95 Celsius fok magas hőmérsékletre melegítik, az, hogy minél hosszabb a DNS kettős szál, annál inkább együtt akar maradni. A DNS hossza az egyik tényező, amely befolyásolja az adott DNS-darabon a PCR-re választott olvadáspontot. A kettős szálú DNS-kötésben lévő A-T és G-C bázispárok összekapcsolják a kettős szálú szerkezetet. Minél több egymást követő bázispár kötődik két egyszálúhoz, annál inkább a szomszédaik is kötődni akarnak, és annál erősebbé válik a vonzalom a két szál között. Olyan, mint egy kis mágnesekből készült cipzár. Amint becsukja a cipzárt, a mágnesek természetesen fel akarnak húzódni és cipzárban maradni.

Egy másik tényező, amely befolyásolja, hogy milyen olvadási hőmérsékletet válasszon a kívánt DNS-fragmens számára, az a fragmensben lévő G-C bázispárok mennyisége. Minden alappár olyan, mint két mini mágnes, amelyek vonzanak. Egy G-ből és C-ből készült pár sokkal erősebben vonzódik, mint egy A és T pár. Így egy olyan DNS-darabnak, amelynek több G-C párja van, mint egy másik fragmensnek, magasabb hőmérsékletre lesz szüksége, mielőtt egyes szálakká olvadna. A DNS természetesen elnyeli az ultraibolya fényt - egészen pontosan a 260 nanométeres hullámhosszon -, az egyszálú DNS pedig több fényt nyel el, mint a kétszálú DNS. Tehát az elnyelt fény mennyiségének mérése egy módszer annak mérésére, hogy mennyire olvadt el kettős szálú DNS-ed egyetlen szálakká. A G-C és A-T bázispárok "mágneses cipzár" hatása okozza a kettős szálú DNS-t ábrázolják a hőmérséklet emelkedésével szemben, hogy legyen sigmoidális, S alakú, és ne a egyenes. Az S görbéje azt a csapatmunka-ellenállást képviseli, amelyet az alappárok a hő ellen kifejtenek, mert nem akarnak elválni.

Azt a hőmérsékletet, amelynél a DNS hosszúsága egyes szálakká olvad, olvadáspontjának nevezzük, amelyet „Tm” rövidítéssel jelölünk. Ez azt a hőmérsékletet jelzi, amelynél az oldatban lévő DNS fele egyetlen szálra olvadt, a másik fele pedig még mindig kettős szálú forma. Az olvadás hőmérséklete a DNS minden fragmensénél eltérő. Az emlős DNS G-C tartalma 40%, vagyis a bázispárok fennmaradó 60% -a As és Ts. 40% -os G-C tartalma miatt az emlősök DNS-e megolvad 87 Celsius fokon (kb. 189 Fahrenheit). Ezért az emlős DNS-en végzett PCR első lépése az, hogy 94 Celsius-fokra (201 Fahrenheit) melegítse. Csak hét fokkal melegebb, mint az olvadási hőmérséklet, és az összes kettős szál teljesen megolvad egyetlen szálra.