DNS
Dezoxiribonukleinsav és fehérjék. A DNS géneknek nevezett egységekbe szerveződik, amelyek mindegyike egy adott RNS vagy fehérje szekvenciát kódol. A géneket tanulmányozzuk, hogy megismerjük az élő rendszerek biológiai szerkezetét és működését, evolúcióját, betegségeit és sok más szempontját. A gének részletes tanulmányozásához a DNS-t el kell különíteni és meg kell tisztítani a kérdéses sejtekből.
DNS-kivonás
Bár egyetlen sejtből származó DNS kinyerhető és tanulmányozható, nem elég, ha szabad szemmel látja. Annak érdekében, hogy elegendő mennyiséget kapjon a spoolozáshoz, minél több cellával kell dolgoznia, annál jobb (sok millió).
A pontos protokollok jelentősen eltérnek, figyelembe véve az egyes minták egyedi jellemzőit, de az általános lépések a homogenizálás, a lízis, az emésztés, az elválasztás és a gyűjtés. Az eljárást a legjobban egy kis (a minta méretétől függően) üveg- vagy műanyag csőben lehet végrehajtani.
A mintákat általában összekeverik vagy felaprítják, hogy a sejteket alaposan elválasszák egymástól. Ezáltal a sejtösszetevők hozzáférhetőbbek lesznek a következő reagensek számára. Ezután mosószert vagy enzimeket adnak a homogenizátumhoz a sejtmembránok (és a sejtmembránok, ha a sejtek eukarióta) lizálása a DNS felszabadítása érdekében. Ezen a ponton a DNS-t fehérjék, lipidek, szénhidrátok veszik körül, minden más, ami a sejtekben volt.
További enzimatikus emésztésre lehet szükség a fehérjék lebontásához, így azok nem kötődnek a DNS-hez, és nem zavarják annak gyűjtését. A DNS-t a sejttartalom többi részétől hideg, tiszta, etil- vagy izopropil-alkohol hozzáadásával választják el. A DNS nem oldódik ezekben az alkoholokban, így kondenzálódik, hogy megpróbálja minimalizálni az alkohollal való érintkezését. Ezután a kondenzált DNS összegyűlt, általában centrifugálással vagy orsó segítségével.
DNS spooling
A spoolozással történő DNS-gyűjtés akkor hatékony, ha extrakciós eljárással nagy mennyiségű DNS-t nyernek. Ez szintén kiváló demonstrációs módszer, mivel a tiszta DNS lenyűgöző gubanca jól látható.
A DNS tekercseléséhez az elválasztási lépést gondosan kell végrehajtani. Ha ez nem része a korábban hozzáadott lízisreagens-keveréknek, akkor az alkohol-adagolási lépés előtt tömény sóoldatot (nátrium-klorid) kell hozzáadni. A hideg alkoholt lassan leöntik a kémcső oldalán, hogy a keverés elkerülése végett réteget képezzen a vizes oldat tetején. Ha helyesen történik, az alkohol a sós réteg tetején saját réteget képez. Aztán jön az orsó.
A sós rétegből származó DNS összegyűjtéséhez óvatosan helyezzen egy üveg keverőrudat az alkoholréteg mellett, amíg az a cső aljához nem ér. Lassan forgassa el a rudat az ujjak között, miközben figyeli a két réteg közötti interfészt. Ha elegendő DNS van jelen, akkor a rétegek közötti határfelületen összeomlik, és tejszerű áttetsző masszát képez. Forgassa meg a rudat, hogy a DNS köré tekerje (ez az orsó része), és húzza ki a csőből. A DNS átkerülhet egy másik tiszta alkohol tubusba tárolás vagy további elemzés céljából.