DNS-klónozás: meghatározás, folyamat, példák

Lehetséges egész szervezeteket klónozni, például Dolly juhokat, de a DNS klónozása más. Készítéséhez molekuláris biológiai technikákat alkalmaz a DNS-szekvenciák vagy egyes gének azonos másolatai.

Géntechnikai módszerek segítségével azonosítják és izolálják a DNS genetikai kódjának szegmenseit. A DNS-klónozás ezután lemásolja a nukleinsav szekvenciák a szegmensekben.

A kapott azonos másolatok felhasználhatók további kutatásokhoz vagy biotechnológiai alkalmazásokhoz. Gyakran a lemásolt gén olyan fehérjét kódol, amely része lehet az orvosi kezeléseknek. DNS-technológia, beleértve DNS-klónozás támogatja annak megértését, hogy a gének hogyan működnek, és az emberek genetikai kódja hogyan befolyásolja a test működését.

A DNS-klónozás az a molekuláris biológiai folyamat, amelynek során a fejlett szervezetek genetikai kódját tartalmazó kromoszómákban található DNS-szegmensek azonos másolatokat készítenek.

A folyamat nagy mennyiségeket generál a cél DNS szekvenciák

A DNS-klónozásban alkalmazott két módszert nevezzük plazmid vektor és polimeráz láncreakció (PCR). Ban,-ben plazmid vektor módszerrel a DNS-szálakat vágjuk restrikciós enzimek DNS-fragmensek előállításához, és a kapott szegmenseket a további duplikáció érdekében plazmidoknak nevezett klónozó vektorokba helyezzük. A plazmidokat baktériumsejtekbe helyezzük, amelyek ezután előállítják a DNS-másolatokat vagy a kódolt fehérjéket.

Ban,-ben PCR módszer, a duplikálandó DNS-szálak szegmensét úgynevezett enzimekkel jelöljük alapozók. Egy polimeráz enzim másolatokat készít a DNS-szál megjelölt részéről. Ez a módszer nem használ restrikciós enzimeket, és kis mintákból klónozott DNS-t képes előállítani. Néha a két DNS-technológiai módszert együtt alkalmazzák, hogy mindegyik legjobb tulajdonságait beépítsék egy átfogó reakcióba.

A módszer vektora a klónozni kívánt célszegmens megtartására használt plazmidra utal. A plazmidok kis kör alakú szálak nem kromoszomális DNS számos organizmusban megtalálható, beleértve a baktériumokat és vírusokat is.

A bakteriális plazmidok azok a vektorok, amelyeket a cél DNS szegmens baktérium sejtekbe történő beillesztésére használnak a további duplikáció érdekében.

A cél DNS kiválasztása és izolálása: A DNS-klónozási folyamat megkezdése előtt meg kell határozni a DNS-szekvenciákat, különösen a DNS-szegmensek kezdetét és végét.

Ilyen DNS-szekvenciák megtalálhatók ismert szekvenciákkal rendelkező meglévő klónozott DNS felhasználásával, vagy a cél DNS-szekvencia által termelt fehérje tanulmányozásával. Amint a szekvencia ismert, a megfelelő restrikciós enzimek használhatók.

A cél DNS vágása restrikciós enzimekkel: A restrikciós enzimeket úgy választjuk ki, hogy a DNS-kódot a célszekvenciák elején és végén keressük.

Amikor a restrikciós enzimek megtalálják a bázispárok speciális kódolt szekvenciáját, az úgynevezett restrikciós helyeket, akkor kapcsolódjanak az adott helyen lévő DNS-hez, és tekerjék körbe a DNS-molekulát, megszakítva a part. A célszekvenciát tartalmazó vágott DNS-szegmensek már megkettőzhetők.

A plazmidvektor kiválasztása és a cél DNS beillesztése: Egy alkalmas plazmid ideális esetben ugyanazokat a DNS-t kódoló szekvenciákat tartalmazza, mint azok a DNS-szálak, amelyekből a cél DNS-t kivágták. A plazmid körkörös DNS-szálát ugyanazokkal a restrikciós enzimekkel vágjuk le, mint amelyeket a cél-DNS vágására használtunk.

A DNS-ligáz enzim a DNS-szegmens összekapcsolódásának elősegítésére használják, és a cél DNS-szegmens végei összekapcsolódnak a plazmid DNS vágott végeivel. A cél DNS most a kör alakú plazmid DNS szál részét képezi.

A plazmid beillesztése egy bakteriális sejtbe: Amint a plazmid tartalmazza a klónozandó DNS-szekvenciát, a tényleges klónozás az úgynevezett eljárás segítségével történhet bakteriális transzformáció. A plazmidokat egy bakteriális sejtbe, például E-be inszertáljuk. coli, és az új DNS-szegmensekkel rendelkező sejtek elkezdik a másolatok és a megfelelő fehérjék termelését.

Bakteriális transzformáció során a gazdasejteket és a plazmidokat együtt inkubálják testhőmérsékleten körülbelül 12 órán át. A sejtek felszívják a plazmidok egy részét, és saját plazmid DNS-ként kezelik őket.

A klónozott DNS és fehérjék betakarítása: A legtöbb DNS-klónozáshoz használt plazmid rendelkezik antibiotikum-rezisztencia gének beépülnek a DNS-be. Amint a baktériumsejtek felszívják az új plazmidokat, rezisztenssé válnak az antibiotikumokkal szemben.

Ha a tenyészetet antibiotikumokkal kezelik, csak azok a sejtek maradnak életben, amelyek felszívták az új plazmidokat. Az eredmény egy tiszta baktériumsejt-tenyészet klónozott DNS-sel. Ezt a DNS-t akkor lehet összegyűjteni, vagy a megfelelő fehérjét elő lehet állítani.

A PCR A módszer egyszerűbb, és a meglévő DNS-t másolja a helyére. Nem igényel restrikciós enzimekkel történő vágást vagy behelyezést plazmidDNS szekvenciák. Ez különösen alkalmassá teszi korlátozott számú DNS-szálat tartalmazó DNS-minták klónozására. Bár a módszer klónozhatja a DNS-t, nem használható a megfelelő fehérje előállításához.

A DNS-szálak kibontása: A kromoszómákban lévő DNS szorosan tekercselt kettős spirálszerkezetben. A DNS-t 96 Celsius-fokig melegítjük az úgynevezett folyamatban denaturáció a DNS-molekula tekercsét és két szálra szétválik. Erre az elválasztásra azért van szükség, mert egyszerre csak egyetlen DNS-szál klónozható.

Az alapozók kiválasztása: A plazmid vektor DNS klónozásához hasonlóan a klónozandó DNS szekvenciákat is azonosítani kell, különös hangsúlyt fektetve a DNS szegmensek kezdetére és végére. A primerek olyan enzimek, amelyek specifikus DNS-kódszekvenciákhoz kapcsolódnak, és ezeket a cél DNS-szegmensek megjelölésére kell kiválasztani. A megfelelő primerek a DNS-molekula szekvenciákhoz kapcsolódnak, hogy megjelöljék a célszegmensek kezdetét és végét.

A primerek megkötésének reakciójának izzítása: A reakció körülbelül 55 Celsius-fokosra történő lehűtését hívjuk izzítás. Amint a reakció lehűl, a primerek aktiválódnak, és a cél DNS-szegmens mindkét végén a DNS-szálhoz kapcsolódnak. A primerek csak markerként működnek, és a DNS-szálat nem kell levágni.

A cél DNS szegmens azonos másolatainak előállítása: Az úgynevezett folyamatban kiterjesztés, a hőérzékeny TAQ polimeráz enzimet adjuk a reakcióhoz. A reakcióelegyet ezután 72 Celsius fokig melegítjük, aktiválva az enzimet. Az aktív DNS-polimeráz enzim kötődik a primerekhez és lemásolja a DNS-szekvenciát közöttük. A kezdeti DNS-szekvenálási és klónozási folyamat befejeződött.

A klónozott DNS hozamának növelése: A kezdeti hőkezelési és meghosszabbítási folyamat viszonylag kevés példányt hoz létre a rendelkezésre álló DNS-szál szegmensekből. A további DNS-replikáció révén a hozam növelése érdekében a reakciót ismét lehűtjük, hogy újraindítsuk a primereket, és hagyjuk, hogy kötődjenek más DNS-szálakhoz.

Ezután a reakció újbóli felmelegítése ismét aktiválja a polimeráz enzimet, és további másolatok keletkeznek. Ez a ciklus 25-30-szor megismételhető.

A plazmidvektor-módszer a DNS-nek a kezdeti bőséges ellátására támaszkodik a plazmidok kivágására és beillesztésére. A túl kevés eredeti DNS kevesebb plazmidot eredményez, és lassan indul a klónozott DNS-termelés.

A PCR-módszer nagy mennyiségű DNS-t képes előállítani néhány eredeti DNS-szálból, de mivel a DNS-t nem ültetik be egy baktériumsejtbe, fehérjetermelés nem lehetséges.

A kis kezdeti DNS-mintából klónozandó DNS-fragmensekben kódolt fehérje előállításához a két módszer együttesen alkalmazható, és kiegészítik egymást. Először a PCR-eljárást használják a DNS kis mintából történő klónozására és sok másolat előállítására.

Ezután a PCR termékeket a plazmid vektor módszerrel felhasználjuk a megtermelt DNS beültetésére olyan baktérium sejtekbe, amelyek előállítják a kívánt fehérjét.

A molekuláris biológia génklónozást és DNS-replikációt alkalmaz orvosi és kereskedelmi célokra. A klónozott DNS-szekvenciával rendelkező baktériumokat olyan gyógyszerek előállítására és olyan anyagok helyettesítésére használják, amelyeket genetikai rendellenességekkel küzdő emberek nem tudnak előállítani.

A tipikus felhasználások a következők:

• A gén humán inzulin baktériumokba klónozzák, amelyek aztán előállítják a cukorbetegek által használt inzulint.
• A szöveti plazminogén aktivátort klónozott DNS-ből állítják elő és segítik megakadályozza a vérrögképződést.
• Az emberi növekedési hormon elő lehet állítani és beadni azoknak az embereknek, akik maguk nem tudják előállítani.

A biotechnológia a génklónozást a mezőgazdaságban is felhasználja, hogy új tulajdonságokat hozzon létre a növényekben és az állatokban, vagy javítsa a meglévő jellemzőket. Amint több gént klónoznak, a lehetséges felhasználások száma exponenciálisan növekszik.

A DNS-molekulák az élő sejt egy kis részét teszik ki az anyagnak, és nehéz elkülöníteni a sok gén hatásait. A DNS-klónozási módszerek nagy mennyiségű specifikus DNS-szekvenciát juttatnak el a tanulmányozáshoz, és a DNS ugyanúgy termel fehérjéket, mint az eredeti sejtben. A DNS-klónozás lehetővé teszi ennek a műveletnek a különféle gének külön-külön történő tanulmányozását.

A tipikus kutatási és DNS-technológiai alkalmazások a következőket vizsgálják:

• A gén funkciója.
• Egy gén mutációi.
• Gén expresszió.
• Géntermékek.
• Genetikai hibák.

Ha több DNS-szekvenciát klónoznak, könnyebb további szekvenciákat megtalálni és klónozni. A meglévő klónozott DNS-szegmensek felhasználhatók annak meghatározására, hogy egy új szegmens megfelel-e a réginek, és mely részek különböznek egymástól. A cél DNS szekvencia azonosítása ekkor gyorsabb és pontosabb.

Ban ben génterápia, klónozott gént mutatnak be egy olyan szervezet sejtjeinek, amelynek természetes génje sérült. Egy létfontosságú gén, amely egy adott szervezet működéséhez szükséges fehérjét termeli, mutálódhat, sugárzás által megváltoztatható vagy vírusok befolyásolhatják.

Amikor a gén nem működik megfelelően, a sejtből hiányzik egy fontos anyag. A génterápia megpróbálja cserélje ki a gént egy klónozott változatra, amely előállítja a szükséges anyagot.

A génterápia még mindig kísérleti jellegű, és kevés beteget gyógyítottak meg a technika alkalmazásával. A problémák az egyetlen, az egészségi állapotért felelős gén azonosításával és a gén sok példányának a megfelelő sejtekbe juttatásával járnak. Mivel a DNS-klónozás egyre szélesebb körben elterjedt, a génterápiát számos speciális helyzetben alkalmazták.

A legutóbbi sikeres alkalmazások a következőket tartalmazzák:

• Parkinson kór: Vektorként vírust használva Parkinson-kórral kapcsolatos gént injektáltak a betegek középagyaiba. A betegek javultak a motorikus képességekben, káros mellékhatások nélkül.
• Adenozin-deamináz (ADA) hiány: Genetikai immunrendellenességet úgy kezeltek, hogy eltávolították a betegek vér őssejtjeit és beillesztették az ADA gént. Ennek eredményeként a betegek legalább saját ADA-jukat tudták előállítani.
• Vérzékenység: A hemofíliában szenvedők nem termelnek specifikus fehérjéket, amelyek elősegítik a vérrögképződést. Az egyik hiányzó fehérje termelésére szolgáló gént beillesztettük a betegek májsejtjeibe. A betegek termelték a fehérjét, és a vérzési incidensek csökkentek.

A génterápia a DNS-klónozás egyik legígéretesebb alkalmazása, de más új felhasználások valószínűleg szaporodni fognak, mivel több DNS-szekvenciát tanulmányoznak és meghatározzák azok működését. A DNS-klónozás a szükséges mennyiségben juttatja el a géntechnológia alapanyagát.

Amikor a gének szerepe ismert és megfelelő működésük a hibásak pótlásával biztosítható gének, számos krónikus betegség, sőt rák is támadható és kezelhető genetikai szinten DNS segítségével technológia.

Kapcsolodo tartalom:

• Az E.Coli (Escherichia Coli) telepi jellemzői
• RNS: Definíció, Funkció, Struktúra