DNS-szekvenálás: meghatározás, módszerek, példák

A nukleotidok az élet kémiai építőkövei, és megtalálhatók az élő szervezetek DNS-ében. Minden nukleotid áll egy cukrot, foszfát és a nitrogéntartalmú bázis: adenin (A), timin (T), citozin (C) és guanin (G). Ezeknek a nukleotidbázisoknak a sorrendje határozza meg, mely fehérjéket, enzimeket és molekulákat szintetizálja a sejt.

A nukleotidok sorrendjének vagy szekvenciájának meghatározása fontos a mutációk, evolúció, betegség progresszió, genetikai tesztelés, törvényszéki vizsgálat és orvoslás.

Genomika a DNS, a gének, a gén kölcsönhatások és a génekre gyakorolt ​​környezeti hatások vizsgálata. A gének bonyolult belső működésének kibontakozásának titka az, hogy képesek azonosítani szerkezetüket és elhelyezkedésüket a kromoszómákon.

Az élő organizmusok tervét a DNS-ben található nukleinsav-bázispárok sorrendje (vagy szekvenciája) határozza meg. Amikor a DNS replikálódik, az adenin párosul a timinnel, a citozin pedig a guaninnal; nem egyező párokat vesznek figyelembe mutációk.

Mivel a kettős spirál dezoxiribonukleinsav (DNS) molekulát 1953-ban fogalmazták meg, drámai fejlesztések történtek a genomika és a nagyméretű DNS-szekvenálás terén. A tudósok szorgalmasan dolgoznak ezen új ismeretek alkalmazásával a betegségek individualizált kezelésében.

A folyamatban lévő megbeszélések ugyanakkor lehetővé teszik a kutatók számára, hogy megelőzzék az ilyen gyorsan robbanó technológiák etikai következményeit.

A DNS-szekvenálás a különböző nukleotidbázisok szekvenciájának felfedezése a DNS-részletekben. A teljes gén szekvenálás lehetővé teszi az azonos és különböző fajokban jelenlévő kromoszómák és genomok összehasonlítását.

A kromoszómák feltérképezése hasznos a tudományos kutatáshoz. A mechanizmusok és struktúra elemzése gének, a DNS molekulák alléljai és kromoszóma mutációi új módszereket javasolnak például a genetikai rendellenességek kezelésére és a rákos daganatok növekedésének megállítására.

Frederick Sanger DNS-szekvenálási módszerei az 1970-es évektől kezdve jelentősen előrehaladt a genomika területén. Az inzulin tanulmányozása után Sanger készen állt arra, hogy megoldja a DNS-szekvenálást, miután sikeresen szekvenálta az RNS-t. Sanger nem az első tudós, aki a DNS-szekvenálással foglalkozott. Okos DNS-szekvenálási módszerei - amelyeket Berg és Gilbert kollégákkal együtt fejlesztettek ki - 1980-ban Nobel-díjat nyert.

Sanger tudta munkájának potenciális értékét, és gyakran dolgozott más tudósokkal, akik osztották az érdeklődését a DNS iránt molekuláris biológia és élettudomány.

Bár lassú és drága a mai szekvenálási technológiákhoz képest, Sanger DNS-szekvenálási módszereit annak idején dicsérték. Próba és tévedés után Sanger megtalálta a titkos biokémiai „receptet” a DNS-szálak elválasztására, további DNS-ek létrehozására és a nukleotidok sorrendjének azonosítására a genomban.

Kiváló minőségű anyagok könnyen megvásárolhatók laboratóriumi vizsgálatokhoz:

• DNS-polimeráz a DNS előállításához szükséges enzim.
• DNS primer megmondja az enzimnek, hogy hol kezdjen dolgozni a DNS-szálon.
• dNTP-k szerves molekulák, amelyek dezoxiribóz-cukorból és nukleozid-trifoszfátokból állnak - dATP, dGTP, dCTP és dTTP - amelyek összegyűjtik a fehérjéket
• Lánc-terminátorok festékszínű nukleotidok, más bázisok terminátor-nukleotidjainak is nevezik - A, T, C és G.

Sanger kitalálta, hogyan lehet a DNS-t kis szegmensekre vágni a DNS-polimeráz enzim segítségével.

Ezután több DNS-t készített egy sablonból, és radioaktív nyomjelzőket helyezett az új DNS-be, hogy elhatárolja az elválasztott szálak metszeteit. Azt is felismerte, hogy az enzimnek olyan primerre van szüksége, amely képes kötődni a templátszál egy meghatározott foltjához. 1981-ben Sanger ismét történelmet írt, amikor kitalálta a mitokondriális DNS 16 000 bázispárjának genomját.

A hőmérsékletet gondosan kell beállítani az egész szekvenálási folyamat során. Először vegyszereket adunk egy csőbe, és felmelegítjük a kettős szál feloldásához (denaturálásához) DNS-molekula. Ezután a hőmérsékletet lehűtjük, lehetővé téve az alapozó megkötését.

Ezután a hőmérsékletet megemeljük az optimális DNS-polimeráz (enzim) aktivitás ösztönzése érdekében.

A polimeráz általában a rendelkezésre álló normál nukleotidokat használja, amelyeket nagyobb koncentrációban adnak hozzá. Amikor a polimeráz „láncvégződő” festékkel kapcsolt nukleotidhoz jut, a polimeráz leáll, és a a lánc ott ér véget, ami megmagyarázza, miért nevezik a festett nukleotidokat „láncvégződéseknek” vagy „Terminátorok”.

A folyamat sokszor folytatódik. Végül a festékkel kapcsolt nukleotidot a DNS-szekvencia minden egyes pozíciójába helyezték. A gélelektroforézis és a számítógépes programok ezután azonosíthatják a festék színeit az egyes DNS-szálakon és kitalálni a DNS teljes szekvenciáját a festék, a festék helyzete és a festék hossza alapján szálak.

Nagy áteresztőképességű szekvenálás - általában a következő generációs szekvenálás - új fejlesztéseket és technológiákat alkalmaz a nukleotidbázisok gyorsabb és olcsóbb szekvenálására, mint valaha. Egy DNS-szekvenáló gép könnyen képes kezelni a nagyméretű DNS-szakaszokat. Valójában a teljes genom órák alatt elvégezhető, évek helyett Sanger szekvenálási technikáival.

A következő generációs szekvenálási módszerek nagy mennyiségű DNS-elemzést képesek kezelni az amplifikáció vagy klónozás hozzáadott lépése nélkül, hogy elegendő DNS-t kapjanak a szekvenáláshoz. A DNS-szekvenáló gépek egyszerre több szekvenálási reakciót hajtanak végre, ami olcsóbb és gyorsabb.

Lényegében az új DNS-szekvenálási technológia Sanger-reakciók százait futtatja egy kicsi, könnyen olvasható mikrochipen, amelyet aztán a szekvenciát összeállító számítógépes programon keresztül futtatnak.

A technika rövidebb DNS-fragmenseket olvas, de még mindig gyorsabb és hatékonyabb, mint Sanger szekvenálási módszerei, így akár nagyszabású projektek is gyorsan megvalósíthatók.

A Emberi Genom Projekt, amely 2003-ban készült el, az egyik legismertebb szekvencia tanulmány, amelyet eddig végeztek. A 2018-as cikk szerint Science News, az emberi genom kb 46,831 gén, amely félelmetes kihívást jelentett a szekvenciára nézve. A világ legjobb tudósai csaknem 10 évet töltöttek együtt és tanácskoztak. A Nemzeti Emberi Genomkutatás vezetésével

Intézet, a projekt sikeresen feltérképezte az emberi genomot névtelen véradóktól vett összetett minta felhasználásával.

A Humán Genom Projekt bakteriális mesterséges kromoszóma (BAC alapú) szekvenálási módszerekre támaszkodott az alappárok feltérképezéséhez. A technika baktériumokat használt a DNS-fragmensek klónozásához, ami nagy mennyiségű DNS-t eredményezett a szekvenáláshoz. Ezután a klónok méretét lecsökkentettük, szekvenáló gépbe helyeztük és emberi DNS-t képviselő szakaszokba állítottuk össze.

A genomika új felfedezései mélyen megváltoztatják a betegségek megelőzésének, felderítésének és kezelésének megközelítését. A kormány dollármilliárdokat szánt a DNS-kutatásra. A bűnüldözés DNS-elemzésre támaszkodik az esetek megoldásában. DNS-tesztkészletek megvásárolhatók otthoni használatra az ősök kutatásához és az egészséget veszélyeztető génvariánsok azonosításához:

• Genomikai elemzés számos különböző faj genomszekvenciájának összehasonlítását és összehasonlítását jelenti az élet területén és királyságaiban. A DNS-szekvenálás felfedheti azokat a genetikai mintákat, amelyek új megvilágításba kerülnek, amikor bizonyos szekvenciákat evolúciósan vezetnek be. Az ősök és a migráció DNS-elemzéssel követhető nyomon, és összehasonlítható a történelmi feljegyzésekkel.

• Az orvostudomány fejlődése exponenciális sebességgel történnek, mert gyakorlatilag minden emberi betegségnek van genetikai összetevője. A DNS-szekvenálás segít a tudósoknak és az orvosoknak megérteni, hogy több gén hogyan hat egymással és a környezettel. A betegség kitörését okozó új mikroba DNS-ének gyors szekvenálása segíthet a hatékony gyógyszerek és oltások azonosításában, még mielőtt a probléma súlyos közegészségügyi problémává válna. A rákos sejtekben és a daganatokban található génvariánsok szekvenálhatók és felhasználhatók individualizált génterápiák kifejlesztésére.

• Kriminalisztika az 1980 - as évek vége óta a bűnüldöző szervek segítségével az 1980 - as évek vége óta a bűnüldöző szervek segítenek a bűnüldöző szervek felszámolásában Országos Igazságügyi Intézet. A bűnügyi helyszíni bizonyítékok tartalmazhatnak csontból, hajból vagy testszövetből származó DNS-mintákat, amelyek összehasonlíthatók a gyanúsított DNS-profiljával a bűnösség vagy az ártatlanság megállapítása érdekében. A polimeráz láncreakció (PCR) egy általánosan alkalmazott módszer a DNS másolására nyomok alapján a szekvenálás előtt.

• Újonnan felfedezett fajok szekvenálása segíthet azonosítani, mely más fajok vannak a legszorosabb kapcsolatban, és információt tárni az evolúcióról. A taxonómusok DNS-vonalkódokat használnak az élőlények osztályozásához. Szerint a Georgia Egyetem 2018 májusában becslések szerint még 303 emlősfaj fedezhető fel.

• Betegségek genetikai vizsgálata keresse meg a mutált génvariánsokat. Legtöbbjük egyetlen nukleotid polimorfizmus (SNP), ami azt jelenti, hogy a szekvenciában csak egy nukleotid változik a „normál” változattól. A környezeti tényezők és az életmód befolyásolják bizonyos gének expresszióját. A globális vállalatok élvonalbeli új generációs szekvenálási technológiákat tesznek elérhetővé a kutatók számára szerte a világon, akik érdeklődnek a multigén interakciók és az egész genom szekvenálása iránt.

• Genealógiai DNS készletek az adatbázisukban lévő DNS-szekvenciákat felhasználva ellenőrizzék az egyén génjeiben található variánsokat. A készlethez nyálminta vagy arctörlő szükséges, amelyet postai úton elküldenek egy kereskedelmi laboratóriumba elemzés céljából. Az ősökről szóló információk mellett egyes készletek azonosíthatják az egyetlen nukleotid polimorfizmusát (SNP) vagy más jól ismert genetikai variánsok, például a BRCA1 és BRCA2 gének, amelyek a női emlő megnövekedett kockázatával járnak petefészekrák.

Az új technológiák gyakran járnak társadalmi előnyökkel és károkkal is; Ilyen például a hibásan működő atomerőművek és a tömegpusztító atomfegyverek. A DNS-technológiák szintén kockázatokkal járnak.

A DNS-szekvenálás és a génszerkesztő eszközök, például a CRISPR érzelmi aggályai között szerepelnek a félelmek, hogy a A technológia megkönnyítheti az emberi klónozást, vagy mutáns transzgenikus állatokhoz vezethet, amelyeket egy szélhámos hoz létre tudós.

Gyakrabban a DNS-szekvenálással kapcsolatos etikai kérdések megalapozott beleegyezéssel kapcsolatosak. A közvetlen fogyasztói DNS-vizsgálatokhoz való könnyű hozzáférés azt jelenti, hogy a fogyasztók nem tudják teljesen megérteni, hogyan használják fel, tárolják és osztják meg genetikai információikat. A laikus emberek nem biztos, hogy érzelmileg készek megismerni hibás génváltozataikat és egészségügyi kockázataikat.

Harmadik felek, például a munkaadók és a biztosító társaságok diszkriminálhatják azokat a személyeket, akik olyan hibás géneket hordoznak, amelyek súlyos egészségügyi problémákat okozhatnak.