A rekombináns DNS (dezoxiribonukleinsav) a DNS összekapcsolásával létrehozott szintetikus típusú nukleinsav olyan szekvenciák együtt, amelyek normális körülmények között és környezeti körülmények között természetesen nem léteznének körülmények.
A rekombináns DNS előállításának folyamatát általában rekombináns plazmiddal végezzük. Pontosabban, a biológia és a genetika fejlett DNS-technológiai eljárásával, génklónozásként ismert. A rekombináns DNS-t egy sejtbe helyezik, amely ezután egy teljesen új fehérjét állít elő, és gyógyszerek, antitestek vagy specifikus fehérjék szintetizálására szolgál kizárólag kutatási célokra.
Bevezetés a rekombináns DNS technológiába
A donor szervezetből vagy biológiai forrásból származó DNS-t először a sejtekből extrahálják, majd enzimes restrikciónak nevezett vágási folyamatnak vetik alá. Ez olyan DNS-fragmenseket generál, amelyek tartalmazzák a kérdéses gént vagy géneket. Ezeket a fragmenseket ezután "klónozhatjuk" (azaz beilleszthetjük) vagy ragaszthatjuk a befogadó organizmus fragmenseire.
Ezután nagyobb DNS molekulákba ("rekombináns plazmid") inszertálják, amelyeket baktériumokba helyeznek és hagyják szaporodni. A rekombináns DNS-t ezután kinyerjük és ellenőrizzük.
További információ a rekombináns DNS technológia előnyeiről és hátrányairól.
DNS izolálása
A DNS-t először ki kell vonni és meg kell tisztítani más sejtmolekulákból, például ribonukleinsavakból (RNS-ek), fehérjékből és struktúrákból, például sejtmembránokból. Klónozás céljából a DNS-t a sejtmagból nyerik, és "genomi DNS" néven ismerik. A DNS egyik általános módszere az extrakció a sejtkomponensek ultracentrifugálásával, sűrűséggradiensben, cézium-etidium-bromiddal klorid.
Alternatív megoldásként lúgos és só-puffer mosások sorozatát is fel lehet használni a DNS kinyerésére. Miután ezt kicsapják és megtisztítják az összes többi nem kívánt szennyeződéstől, a DNS-t töredékekre lehet vágni.
Restrikciós enzim DNS emésztése
A restrikciós enzimek olyan enzimek, amelyek nagyon specifikus DNS-szekvenciákat vágnak fel; egyedi DNS-fragmensek létrehozására szolgálnak. Ez a folyamat biztosítja, hogy egyetlen pontatlan, helytelen vagy nem kívánt szekvencia sem keletkezzen és váljon véletlenül beépül a végső rekombináns DNS-be, ami mind kísérleti kudarcot, mind pedig sejthalál.
A kívánt DNS-fragmensek előállításához egy specifikus egyedi enzimet (enzimeket) használunk a DNS feldarabolására vagy emésztésére. Ezután a fragmenseket gélelektroforézissel tisztítjuk, amely elválasztja őket a nem kívánt DNS-től. A nyersebb DNS-technológiai módszer egyszerűen mechanikus nyírással jár, amely a hosszabb DNS-szegmenseket felaprítja kisebbekre, amelyek felhasználhatók a klónozáshoz.
DNS-ligálás
A ligálás a donor és a befogadó (vagy vektor) DNS-fragmensek összeragadásának vagy összekapcsolásának folyamata rekombináns plazmid DNS-molekula létrehozására. Ideális esetben a fragmensek létrehozására választott restrikciós enzimeket nagyon gondosan átgondolták volna és úgy tervezték volna meg, hogy lehetővé tegyék ezeknek a biteknek a kirakós játékként való összerakását.
Ehhez előnyösek azok a restrikciós enzimek, amelyek kompatibilis "ragadós végeket" eredményeznek, oly módon, hogy az összes kompatibilis fragmens természetesen összekapcsolódjon egymással. Ellenkező esetben a DNS-ligáz enzim felhasználható a DNS-szegmensek foszfodiészter kötésekkel történő összekapcsolására.
Rekombináns DNS-replikáció
Az átalakulás vagy a hősokk folyamata arra szolgál, hogy a rekombináns DNS-molekulát befogadják egy gazdasejt baktérium sejtbe, amely ezután a szintetikus DNS sok másolatát képes előállítani. Ezeket a baktériumokat agarlemezeken növesztik, speciális baktériumlevesekben tenyésztik, majd a rekombináns DNS felszabadítása érdekében lizálják. Végül a DNS ellenőrizhető DNS-szekvenálás, funkcionális kísérletek és restrikciós enzimek emésztésével.
Rekombináns DNS felhasználása
A rekombináns DNS-technológiát az akadémiai laboratóriumi kísérletektől kezdve a gyógyszerek előállításáig mindenre használják. A DNS-szekvenálás és a génazonosítás fontos része is.
Erről további abut felhasználásokat olvashat DNS-technológia itt.
További információ a rekombináns DNS és a géntechnológia közötti különbségről.