Nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) végzett munka során a jó kalibrálás elengedhetetlen a megbízható, minőségi eredmények biztosításához. A HPLC készülék megfelelő kalibrálása megfelelő kalibrációs standard elkészítésével kezdődik. A legtöbb esetben a kalibráláshoz szükség van egy sor növekvő koncentrációjú standardra, hogy előállítsuk az úgynevezett kalibrációs görbét. Ez egy ábrázolt vonal és a hozzá tartozó egyenlet, amely leírja a vizsgálandó vegyi anyag koncentrációja és a HPLC detektor válasza közötti kapcsolatot.
Határozza meg azt a vegyi anyagot, amelyet a HPLC segítségével tesztelni szeretne (az "analit"). Például tesztelhet egy üdítőital-sorozat fruktóztartalmát, ebben az esetben a fruktóz lenne az analit.
Szerezzen be egy megfelelő tisztaságú analit vegyi anyagot. Normális esetben a tisztaságnak 99% felett kell lennie, és az analitot egy jó hírű vegyipari vállalattól kell megvásárolni. A fruktóz esetében például tiszta fruktózt vegyi árustól vásárolna, nem pedig élelmiszerbolttól.
Határozza meg az analit maximális és minimális várható koncentrációját azokban a mintákban, amelyeket HPLC-vel vizsgálni kíván. Üdítők esetén megvizsgálja az italok címkéit, és meghatározza a legalacsonyabb és legmagasabb fruktóztartalmat a tesztelt italok között. Ne feledje, hogy a kiindulási minta (az üdítő) hígítható vagy más módon manipulálható az elemzés előkészítése során (az alkalmazott HPLC-módszertől függően), így a HPLC-re ténylegesen injektált mintákban az analitkoncentráció lehet módosított. Figyelembe kell venni a HPLC-vel futtatott minták analit koncentrációját.
A kalibrációs standardok elkészítéséhez határozza meg az oldószert, amelyben feloldja az analitját. Ennek az oldószernek képesnek kell lennie az analit megfelelő oldására viszonylag széles koncentrációtartományban (legalább olyan magasan, mint a vizsgálni kívánt mintákban). Ezen túlmenően ennek az oldószernek ideális esetben nagyon hasonlónak kell lennie a "mozgófázishoz": az oldószerhez, amelyet a minták HPLC eszközön keresztül történő hordozására használtak.
Számítsa ki az analit "alap törzsoldatának" elkészítéséhez szükséges analit mennyiségét. Ezt úgy találjuk meg, hogy a törzsoldat szükséges koncentrációját megszorozzuk a kívánt térfogattal. Az analit koncentrációjának ebben az oldatban legalább 10% -kal magasabbnak kell lennie, mint a várt legnagyobb minta-koncentráció. Ha az üdítőmintában a várható legnagyobb fruktózkoncentráció 8 gramm / 100 milliliter, akkor a törzsoldat 10 gramm / 100 milliliter koncentrációra állítható be. Az ésszerű térfogat 500 milliliter, ezért 8/100 ml x 500 ml = 40 gramm fruktózra lenne szükség.
Mérjük le a szükséges analit mennyiséget megfelelő pontossággal. Gyakran megfelelő egy vagy két tizedesjegy pontosságú grammban kifejezett súlyérték, de egyes módszereknél nagyobb pontosságra lehet szükség.
Vigye a lemért analitot a szükséges térfogatú mérőlombikba, és adja hozzá a kívánt oldószert a lombik töltési jeléhez. A mérőlombik használata (például nem egy mérőpohár helyett) növeli az alapkoncentráció pontosságát. Győződjön meg arról, hogy az összes analitát átviszi a lombikba; szükség esetén az oldószer egy részét mossa be.
Készítsen egy sor változó hígítású törzsoldatot úgy, hogy a törzsoldat ismert mennyiségeit mérőlombikba helyezi, pipetták segítségével a pontos átvitelhez, majd oldószert adva hozzá. A legalacsonyabb standard koncentrációnak a legkevésbé várható elemzendő minta alatt kell lennie. Az üdítőital-példában, ha a minta legalacsonyabb várható fruktózkoncentrációja 2 gramm / 100 ml, akkor 1 gramm / 100 ml-es standard készülhet. Ezt a részvény standard tízszeres hígításával lehetne elérni. A standard sorozatnak összesen 5 vagy 6 koncentrációt kell tartalmaznia, ezért további hígításokra lenne szükség, ha esetleg 3, 5 és 8 gramm fruktóz / ml standardokat állítunk elő. Most van egy sor standard megoldás, amellyel kalibrálni lehet a HPLC-t.