A nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) egy biokémiai módszer az oldatokban lévő fehérjék azonosítására. Amint Mathews és munkatársai a "Biokémia" című részben bemutatták, a fehérjemintákat először a lyukakba vagy a lyukakba töltik a poliakrilamid-gélblokk egyik végén. Ezután elektromos mezőt vezetünk a gélre. A betöltött mintákhoz hozzáadott SDS tagadja a fehérjék természetes töltését. Emiatt a fehérje molekulatömege önmagában határozza meg a fehérjék migrációs sebességét, miközben a gélen keresztül haladnak a pozitív töltésű pólus felé - jegyzi meg a Bitesize Bio. Az azonos mintában található több fehérje ezért elválik egymástól és különböző pozíciókba vándorol.
Helyezze el a gél fényképet. A "Felső" azon kutak helye, ahová a mintákat eredetileg hozzáadták. A "fenék" az a hely, ahol a minták vándoroltak, és leggyakrabban a festékfrontot tartalmazza, amely a minták vándorló elejét jelzi. Vagy a bal, vagy a jobb oldalnak tartalmaznia kell egy "markert", amelyet kiszámítható molekulatömeg-útmutatóként használnak.
Jelölje meg a mintákat minden sávhoz. A tetején a kutakhoz hozzáadott minták függőlegesen vándorolnak "sávokban". Ezért a függőleges oszlopban látható összes sáv egy közvetlenül a fölötte töltött mintából származott. Használja a vonalzót és a tollat szegélyek elhelyezésére a sávokon, ha nehéz az oszlopokat vizualizálni.
Jelölje meg a sávok molekulaméretét a jelölősávban. A kereskedelemben kapható markerek a sáv mintázatának képével együtt várhatók, és az egyes sávok molekulatömegével együtt. A sávok a sötét horizontális "rudak", amelyek valójában a gélbe ágyazott fehérje festékeket tartalmaznak.
Rajzoljon világos, vízszintes vonalakat, amelyek mindegyik marker sávból a gél ellentétes széléig nyúlnak ki. Vigyázzon, hogy ezek a vonalak párhuzamosak legyenek a kutakkal és a festék elejével. Ezek a vonalak jelzik, hogy az egyes marker sávok által jelzett molekulatömegű fehérjék hol helyezkednek el az egyes sávokban. Például egy sáv a 4. sávban, amely közvetlenül a 25 kilodaltontól húzódó vonal alatt helyezkedik el jelölősáv azt sugallja, hogy a 4. sáv sávja molekulárisan majdnem, de nem egészen 25 kilodalton súly.
Minden sávban jelölje meg a becsült molekulatömeget. Használja a jelölőket útmutatóként, és becsülje meg az értékeket a jelölőméretek között.
A gélfotó alatt készítsen listát az egyes sávok "fehérjéiről". Kezdje azzal, hogy megadja, mi minden egyes mintáról ismert, például annak eredete vagy körülményei. Ezután sorolja fel a sáv egyes sávjainak becsült molekulatömegét. Az egy sávos sávok azt jelzik, hogy a minta csak egy fehérjét tartalmaz. A több sávos sávok több fehérje jelenlétét jelzik. A migrációs fronttal futó sávok kisebbek, mint azt a legközelebbi marker javasolja, és valószínűleg nem lehet megjósolni, kivéve, ha "kisebb", mint a marker jelzi.
A fehérjék listájában vegye figyelembe a furcsaságokat. A "bekent" megjelenés azt jelezheti, hogy túl sok fehérje van jelen, vagy hogy a minta viszkozitása befolyásolta a vándorlását. Ha a sávok túlmutatnak a a sáv szélén vagy meglehetősen nagy a többi sávhoz képest, akkor a fehérje koncentrációja valószínűleg túl magas, és a jövőben hígítani kell elektroforézis. Az egész sáv szürkés árnyalata, sötétebb, mint a háttérzselé, megkülönböztethetetlen fehérjetöredékeket jelez.
Határozza meg a fehérjék azonosságát az egyes sávokban. Bár ezt csak molekulatömeggel végzik, az egyes sávok forrása valószínűleg utalni fog a nyomokra is. Fontolja meg, hogy bizonyos körülmények között a fehérjék dimer vagy trimer asszociációt tudnak fenntartani egy gélen. Ezért egy fehérje három különböző sávként jelenhet meg a gélen. Még akkor is, ha a fehérjék nem azonosíthatók, a sávok relatív sötétsége utalhat az oldatban lévő fehérjék koncentrációjára. Bármilyen kíváncsi és ismeretlen fehérje közvetlenül izolálható az eredeti gélből, és azonosítás céljából elküldhető.
Amire szükséged lesz
- Festett SDS-PAGE gél fényképe
- Kulcs az alkalmazott molekulatömeg-markerhez
- Vonalzó
- Toll