Tris ili tris (hidroksimetil) aminometan uobičajeni je biološki pufer koji se koristi tijekom postupka ekstrakcije DNA. Tijekom ekstrakcije iz bilo kojeg broja izvora, DNA je osjetljiva na pH. Tijekom lize stanica, uklanjanja neželjenih staničnih komponenata i taloženja, tris se koristi za održavanje stabilnog pH. Uz to, igra posebno važnu ulogu u lizi stanice.
TL; DR (predugo; Nisam pročitao)
Ekstrakcija DNK je proces osjetljiv na pH, a upotreba tris pufera pomaže u održavanju pH stabilnim tijekom lize i ekstrakcije stanica.
Tris kao pufer
Kako pH može utjecati i na njega utjecati niz staničnih čimbenika, održavanje stabilnog pH je neophodno za eksperimentalnu znanost. Biološki puferi, poput trisa, važni su jer mogu održavati stabilan pH unatoč utjecajima koji bi u suprotnom mogli pomaknuti pH. Tris (hidroksimetil) aminometan, s pKa 8,1, učinkovit je pufer između pH 7 i 9. Zbog svog neutralnog raspona, tris je uobičajeni pufer u biološkim laboratorijima. Međutim, tris pufer je osjetljiv na temperaturu i treba ga koristiti na temperaturi na kojoj je izvorno pH bio kako bi se izbjegla netočnost.
Liza stanica
Liza ili otvaranje stanica prvi je korak ekstrakcije DNA. To se postiže puferom koji sadrži tris i EDTA (etilendiamintetraoctena kiselina). EDTA veže dvovalentne katione poput kalcija i magnezija. Budući da ti ioni pomažu u održavanju integriteta stanične membrane, njihovo uklanjanje EDTA destabilizira membranu. Tris je glavna komponenta međuspremnika; glavna mu je uloga održavati pH pufera na stabilnoj točki, obično 8,0. Uz to, tris vjerojatno u interakciji s LPS (lipopolisaharidom) u membrani, služeći za destabilizaciju membrane unaprijediti.
Tris štiti DNA od pH promjena
Kad se stanice slome, njihova DNA i sadržaj se izlijevaju u pufer. Uz to su često uključeni RNaza A (uništava RNA), proteaze (uništava proteine) i SDS (natrijev dodecil sulfat, otapa fragmente membrane). Zajedno, ova juha od staničnog sadržaja i fragmentirane RNA i proteina može imati velik utjecaj na pH otopine. Budući da je DNA osjetljiva na pH, važno je da tris puferira juhu i održava pH na stabilnoj točki.
Precipitacija DNA
U završnoj fazi ekstrakcije DNA, sama DNA se ekstrahira iz otopine. U ovom trenutku, DNA je topljiva u puferu. Da bi se ekstrahirala iz otopine, DNK postaje netopiva dodavanjem etanola ili izopropanola (izopropil alkohol). Kada se to učini, DNK postaje očiti u otopini kao bijela tvar. Iako se DNK na taj način može izolirati od preostalih staničnih komponenata, nije "upotrebljiva" kada je netopiva. Nakon izolacije, alkohol se uklanja, a DNA se mora vratiti u biološki pufer, poput trisa, da bi se koristio.
Uradi sam
Iako se ekstrakcija DNK obično vrši u istraživačkim laboratorijima, općenito se koristi jedan od niza komercijalno dostupni kompleti, svatko može kod kuće napraviti ekstrakciju DNA koristeći uobičajene kućanske predmete i zeleno grašak ili špinat. U ovom slučaju, tris, niti bilo koji biološki pufer, nije prisutan kako bi zaštitio DNA od pH promjena. Međutim, to je vizualni način pomoći studentima da se povežu sa staničnom DNA.