Kako se uzorak DNK prikuplja i priprema za proučavanje

Prije nego što mogu sekvencirati DNA ili je promijeniti genetskim inženjeringom, znanstvenici je prvo moraju izolirati. To bi se moglo činiti teškim zadatkom, jer stanice sadrže širok spektar drugih spojeva poput proteina, masti, šećera i malih molekula. Srećom, biolozi mogu upotrijebiti kemijska svojstva DNA kako bi odvojili DNA od tih onečišćenja i pripremili je za daljnje proučavanje. Taj se proces naziva ekstrakcija DNA.

Postoji mnogo različitih tehnika koje se koriste za ekstrakciju DNA. Onaj koji koristi pojedini laboratorij ovisi o vrsti eksperimenta koji treba izvesti i o tome koliko DNK mora biti čista. Znanstvenici obično započinju s uzorkom koji sadrži stanice - primjerice uzorak tkiva ili krvi - i razbijaju stanice ili ih liziraju. Postoje različiti načini na koje možete lizirati stanice. Dodavanjem deterdženta doći će do njihovog razdvajanja, kao i do izlaganja visokofrekventnim zvučnim valovima. Alternativno, miješanjem uzorka sa staklenim kuglicama i brzim vibracijama fizički će se stanice razbiti i osloboditi njihov sadržaj.

Ako nije potrebna visoka čistoća, znanstvenici mogu dodati enzim zvan proteinaza K kako bi razgradili većinu proteina u uzorku, a zatim ga koristiti takvog kakav jest. Ova je tehnika, međutim, vrlo prljava, budući da je većina onečišćenja još uvijek prisutna, pa je prikladna samo ako je brzina prioritet i čistoća nije problem. Još jedan brz i prljav pristup je uklanjanje proteina povećanjem koncentracije soli dodavanjem soli poput amonijaka ili kalijevog acetata kako bi se proteini taložili. I ova je tehnika prilično prljava jer su i dalje prisutni mnogi drugi zagađivači.

Drugi je pristup liziranje stanica deterdžentom, a zatim otopinu pomiješati s izoamil alkoholom, kloroformom i fenolom. Zatim se otopina razdvoji u dva sloja. Proteini završavaju u gornjem organskom sloju, dok DNA ostaje u donjem vodenom sloju. Ova tehnika zahtijeva pažljivu kontrolu koncentracije soli i pH za dobre rezultate. To oduzima vrijeme, a i fenol i kloroform vrlo su otrovne kemikalije. Slijedom toga, dok su ekstrakcije fenol-kloroforma nekada bile rutina, druge su tehnike postale popularnije posljednjih godina.

Anionsko-izmjenjivačka kromatografija nudi veću čistoću i dosljednije rezultate od ekstrakcije fenol-kloroformom. Cijev ili stupac prepuni su malih čestica koje imaju pozitivno nabijena mjesta na kojima se negativno nabijena molekula ili anion mogu vezati. DNA se veže za ta mjesta izmjene aniona, dok se drugi zagađivači poput proteina i RNA ispiru sa kolone. Kasnije se otopina bogata solju koristi za izvlačenje DNA iz kolone.

Najbrža i možda najpouzdanija tehnika za pročišćavanje DNK je uporaba posebno proizvedenog kompleta. Ovi kompleti sadrže membrane od silikagela u cijevi. DNA se lijepi za membranu, dok se druge onečišćenja ispiru pomoću niza posebno pripremljenih otopina soli koje dolaze s kompletom. Konačno, DNA se ispere s kolone otopinom s malo soli. Ovi su setovi brzi, jednostavni za upotrebu i nude ponovljive rezultate.

Nakon što se DNK izolira i resuspendira u otopini pufera kontroliranom pH, posljednji korak je ispitivanje njezine čistoće. To je jednostavan i prikladan način provjerom koliko ultraljubičastog svjetla apsorbira na valnim duljinama od 260 i 280 nanometara. Apsorpcija na 260 nanometara podijeljena apsorpcijom na 280 nanometara trebala bi biti jednaka 1,8 ako je DNA čista. Mjerenje apsorbancije na 260 nanometara također vam omogućuje određivanje koncentracije DNA.