Genetski nacrt stanice kodiran je unutar njezinog genetskog materijala ili DNA. Kako DNA nikada ne napušta jezgru stanice, kako bi te informacije dospjele u citoplazmu gdje god i druge proteini i biokemijske komponente borave, potrebno je prvo transkripirati DNA u glasničku RNA (mRNA ili poli (A) RNK). Ta se mRNA zatim pretvara u proteine koji izvršavaju mnoge funkcije stanice. Da bi se otkrile ili kvantificirale vrlo rijetke mRNA, napravile sonde za mikro nizove ili izgradile knjižnice komplementarnih molekula DNA, mRNA mora biti izolirana. Međutim, ekstrakcija ukupne RNA (tj. Sve RNA u stanici) i naknadna izolacija mRNA nisu međusobno isključivi procesi; prva se mora izvesti kako bi se mRNA mogla ekstrahirati.
TRIzol homogenizacija: Ukupna RNA uključuje svu mRNA, prijenosnu RNA, ribosomsku RNA i druge nekodirajuće RNK. Da bi se odvojile od ostalih staničnih komponenti, stanica se prvo otvori i oslobodi sadržaj. To se postiže resuspendiranjem stanica peletiranih centrifugiranjem (centrifugiranje velikim brzinama) u TRIzol Reagensu (Life Technologies). Ostale verzije TRIzola (poput Ambionovog TRI reagensa) djeluju slično.
Ukupna izolacija RNA: Niz centrifugiranja koristi se za razdvajanje različitih komponenata (proteina, DNA, RNA) stanice u slojeve ili faze unutar suspenzije. Gornja, žuta faza sastoji se od masti i može se odbaciti. Željena faza je obojena crveno, sadrži ukupnu RNA i zadržava se. Nakon ekstrakcije fenol-kloroformom i niza ispiranja alkoholom upotrebom izopropanola i etanola, RNA se može peletirati radi izolacije mRNA. Dodajte inhibitore RNase kako biste spriječili da ovaj enzim razgradi ukupnu RNA.
Ekstrakcija mRNA: Uobičajeno je koristiti komplet za izolaciju mRNA, jer domaći laboratorijski protokoli ne generiraju velike količine visoko pročišćenih mRNA. Komercijalni kompleti uključuju Invitrogenovu FastTrack 2.0 ili Ambionovu poli (A) čistu mRNA izolaciju Kit. Ovi su osnovni koraci zajednički takvim kompletima:
d) Centrifugirajte ovaj uzorak i izvucite supernatant, koji se ispere nekoliko puta u nizu pufera za vezanje i malo soli koji se nalaze u kompletu.
Reference
- "Protokoli knjižnice cDNA?"; Ian G. Cowell i Caroline A. Austin; 1997
- "In vitro transkripcija i protokoli prevođenja?"; Martin J. Timusi; 1995
Savjeti
- Potapajte u led sve reagense, stanice i RNA hladnim. To sprječava razgradnju RNA bilo kojim drugim enzimima koji se oslobađaju tijekom procesa homogenizacije.
Upozorenja
- Reagensi poput TRIzola su otrovni i ne smiju biti u kontaktu s kožom ili sluznicom. Uvijek se pridržavajte sigurnih laboratorijskih protokola prilikom rukovanja ovim reagensom.
o autoru
Palmer Owyoung magistrirao je međunarodno poslovanje na Kalifornijskom sveučilištu u San Diegu i Diplomirani umjetnik sociologije sa Kalifornijskog sveučilišta u Santa Barbari i školovani je molekular biolog. Slobodni je pisac od 2006. godine. Uz pisanje, stalni je Forex trgovac i prodavač Interneta.
Foto bodovi
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images