Spektrofotometrija je neprocjenjiv alat u kemiji i biologiji. Osnovna je zamisao jednostavna: različite tvari apsorbiraju svjetlost / elektromagnetsko zračenje bolje na nekim valnim duljinama nego na drugima. Zbog toga su neki materijali prozirni, dok su drugi, na primjer, obojeni. Kad kroz otopinu osvjetljavate svjetlost određene valne duljine, što je veća njena koncentracija, to će više svjetlosti apsorbirati. Da biste izračunali koncentraciju, morate usporediti svoje očitanje s očitanjima za standarde poznate koncentracije. Postupak u nastavku prilično je generički postupak napisan s obzirom na laboratorij za nastavu kemije, ali ga je moguće izmijeniti i za druge postavke.
Kao i uvijek dok radite u laboratoriju, stavite naočale, rukavice i kaput s dugim rukavima kako biste osigurali vlastitu sigurnost.
Stisnite gumenu žarulju da je ispraznite od zraka, a zatim je stavite na vrh graduirane pipete i pustite da se žarulja opusti tako da usisava vodu u pipetu. Zatim uklonite žarulju i začepite vrh pipete prstom; ovo će zabrtviti pipetu tako da otopina iz nje ne istječe dok vam ne ukloni prst. Lagano podignite rub prsta da malo otopine iscuri iz pipete, dok ne postignete željeni volumen. Vježbajte s malo vode i čašom kako biste stekli osjećaj kako funkcionira graduirana pipeta. Veza u odjeljku Resursi sadrži filmski isječak koji vam pokazuje kako koristiti pipetu u slučaju da nikada prije niste s njom surađivali.
Označite 5 epruveta kao standarde 1-5. Možete ih označiti pomoću selotejpa i olovke ili markerom za suho brisanje.
Odaberite pet koncentracija za svoje standarde. Želite da se standardne koncentracije međusobno odvoje otprilike istim intervalom - npr. 0,1 molar, 0,2 molar, 0,3 molar itd. - i u približno istom opsegu kao što očekujete da će biti i vaša nepoznata. Zasad koristite sljedećih pet koncentracija, ali imajte na umu da ćete ih morati izmijeniti prilikom izvođenja vlastitog eksperimenta:
Standard 1: 0,1 molar Standard 2: 0,2 molar Standard 3: 0,3 molar Standard 4: 0,4 molar Standard 5: 0,5 molar
Zatim uzmite 1 molarnu standardnu otopinu i dodajte sljedeće količine u epruvete 1-5. Zapamtite, ove se količine izračunavaju pomoću gore navedenih koncentracija, pa ćete ih možda trebati modificirati po potrebi prilikom izvođenja vlastitog eksperimenta.
Standard 1: 0,8 mililitara Standard 2: 1,6 mililitara Standard 3: 2,4 mililitara Standard 4: 3,2 mililitara Standard 5: 4 mililitara
Isperite graduiranu pipetu, a zatim prenesite sljedeće količine deionizirane vode:
Standard 1: 7,2 mililitara Standard 2: 6,4 mililitara Standard 3: 5,6 mililitara Standard 4: 4,8 mililitara Standard 5: 4,0 mililitara
U osnovi je ideja dovesti količinu otopine u svakoj epruveti do 8 mililitara.
Pokrijte svaku od standardnih cijevi parafilmom i preokrenite ih da se miješaju.
Označite još pet epruveta kao "Nepoznato 1-5". Dodajte iste količine svoje nepoznate ili test otopine u svaku kao što ste koristili s 1 molarnom otopinom za standarde. Drugim riječima, nepoznati 1 sadržavat će 0,8 mililitara ispitne otopine i 7,2 mililitara vode, nepoznati 2 sadržavat će 1,6 mililitara ispitne otopine i 6,4 mililitara vode i tako dalje dalje.
Pokrijte svaku nepoznatu parafilmom i pažljivo preokrenite da se promiješa.
Uključite spektrofotometar i pustite da se zagrije. Potrebno vrijeme ovisit će o modelu i proizvođaču.
Postavite valnu duljinu na spektrofotometar. Valna duljina ovisit će o vrsti kemikalije u vašem eksperimentu. Za sada pretpostavite 500 nm, iako imajte na umu da ćete to morati promijeniti za različite eksperimente.
Kalibrirajte svoj spektrofotometar. Postupak kalibracije ovisit će o uređaju koji koristite. Za Spectronic 20, uobičajeni model u nastavnim laboratorijima, prvo ćete prilagoditi stroj tako da čita "0 posto T" kada nije učitana kiveta, podesite je tako da glasi "100% T" kada je prazna kiveta koja sadrži samo deioniziranu vodu natovaren. Ovi se postupci mogu razlikovati ovisno o vrsti stroja koji koristite, pa potražite detalje u uputama proizvođača.
Nakon kalibriranja stroja, uzmite standardnu 1 epruvetu i ulijte sadržaj u čistu kivetu dok ne dosegne liniju za punjenje. Obrišite kivetu kimwipeom kako biste uklonili otiske prstiju ili drugu prljavštinu. Umetnite kivetu u spektrofotometar i zabilježite očitanje "% T".
Ponovite ovaj postupak za svih 10 uzoraka. BUDITE ODREĐENI da očistite kivetu između uzoraka kako biste bili sigurni da su vaši rezultati što precizniji.
Uzmite rezultate za svoje standarde i unesite ih u program za proračunske tablice / grafike kao što su Excel ili OpenOffice.
Pomoću programa za proračunske tablice podijelite 100 posto sa svakom od vrijednosti "% T" za standarde, a zatim uzmite zapisnik rezultata. Ovaj izračun dat će vam apsorbanciju. Ako unesete formulu, vaš proračunski program izvršit će izračun umjesto vas.
Primjer: Ako je% T 50,6, formula koju unesete u program proračunskih tablica bila bi sljedeća:
zapisnik (100 / 50,6)
Program proračunskih tablica izvršiće računanje.
Učinite isto za svih pet nepoznatih / eksperimentalnih vrijednosti.
Grafički prikažite vrijednosti apsorbancije za svih pet standarda, s koncentracijom na x osi i apsorbancijom na y osi. Pomoću programa za proračunske tablice na ovaj graf uklopite linearnu jednadžbu. Jednadžba će biti oblika y = mx + b. Većina programa proračunskih tablica imat će funkciju linearne regresije. Pojedinosti o tome kako koristiti značajku linearne regresije potražite u korisničkom priručniku za vaš program proračunskih tablica.
Uzmite jednadžbu za najbolje prikladnu liniju iz vašeg programa proračunskih tablica i riješite je za y oduzimanjem b s obje strane i dijeljenjem obje strane s m. Rezultat će izgledati ovako:
(y - b) / m = x
gdje su b i m vrijednosti koje pronalazi vaš program za proračunske tablice.
Provjerite vrijednosti apsorbancije za nepoznate i odaberite tri koje spadaju u isti raspon kao i standardi. Koristite ove tri vrijednosti apsorbancije za preostale izračune. Ako svih pet spada u isti raspon kao i standardi, umjesto njih možete koristiti svih pet, ali trebate ih koristiti najmanje tri.
Uključite svaku od tri vrijednosti apsorbancije u svoju jednadžbu umjesto y. Imajte na umu da je vaša jednadžba bila u sljedećem obliku:
(y - b) / m = x
Dakle, vrijednost apsorbancije za svaku nepoznatu želju ćete spojiti u jednadžbu umjesto y, a zatim izračunati x. Pomoću programa za proračunske tablice možete za vas napraviti ovaj izračun i ubrzati ga. Sada ste izračunali koncentraciju kemijske tvari koja vas zanima u tri vaše razrijeđene nepoznanice. Izvorna otopina je razrijeđena da bi se pripremile ove nepoznanice, pa sada morate raditi unatrag i izračunati koncentraciju izvorne otopine na temelju faktora razrjeđenja.
Svaki nepoznati uzorak koji ste umetnuli u spektrofotometar razrijeđen je različitom količinom. Slijedom toga, koncentraciju koju ste izračunali na temelju apsorbancije za svako nepoznato očitanje trebali biste podijeliti sa sljedećim:
Nepoznato 1: Podijeli sa 0,1 Nepoznato 2: Podijeli sa 0,2 Nepoznato 3: Podijeli sa 0,3 Nepoznato 4: Podijeli sa 0,4 Nepoznato 5: Podijeli s 0,5
Međutim, imajte na umu da se ove brojke temelje na pretpostavci da koristite prethodno navedena razrjeđenja. Ne zaboravite promijeniti ove vrijednosti ako ste uzorke razrijedili za drugu količinu.
Zbrojite svoje rezultate i podijelite ih s brojem rezultata. To će vam dati prosjek. Prijavite ovaj broj kao svoj nalaz za koncentraciju izvorne otopine.
Stvari koje ćete trebati
- Olovka
- Papir
- Kalkulator
- Rukavice
- Zaštitne naočale
- Kaput s dugim rukavima
- Spektrofotometar
- Staklene kivete
- Parafilm
- Kimwipes
- Deionizirana voda
- Otopina koju želite testirati (nepoznate koncentracije)
- 1 molarna standardna otopina kemikalije prisutne u otopini za ispitivanje
- Diplomirana pipeta i žarulja
- Epruvete i stalak za epruvete
- Čaša
Savjeti
Ovaj postupak možda zvuči složeno, ali zapravo je prilično jednostavan kad jednom započnete. Pokušajte pogledati dva videozapisa u odjeljku Resursi kako biste se upoznali s postupkom.