Kada radite s tekućinskom kromatografijom visokih performansi (HPLC), dobra kalibracija je presudna kako bi se osigurali pouzdani i kvalitetni rezultati. Ispravna kalibracija HPLC instrumenta započinje izradom odgovarajućeg etalona za kalibraciju. U većini slučajeva kalibracija zapravo zahtijeva niz standarda povećanja koncentracije kako bi se proizvela ono što je poznato kao kalibracijska krivulja. Ovo je nacrtana linija i pridružena jednadžba koja opisuje odnos između koncentracije kemikalije koja se ispituje i odziva HPLC detektora.
Odredite kemikaliju koju želite testirati pomoću HPLC-a ("analit"). Na primjer, možda biste željeli testirati niz bezalkoholnih pića na sadržaj fruktoze, u tom bi slučaju fruktoza bila analit.
Nabavite količinu analita odgovarajuće čistoće. Normalno bi čistoća trebala biti iznad 99%, a analit bi se trebao kupiti od renomirane tvrtke za opskrbu kemikalijama. Na primjer, u slučaju fruktoze, čistu fruktozu nabavili biste kod prodavača kemikalija, a ne iz trgovine.
Odredite maksimalnu i minimalnu očekivanu koncentraciju analita u uzorcima koje namjeravate testirati na HPLC. U slučaju bezalkoholnih pića, pregledali biste oznake pića i utvrdili najniži i najveći sadržaj fruktoze među pićima koja ćete testirati. Imajte na umu da se početni uzorak (bezalkoholno piće) može razrijediti ili na drugi način manipulirati tijekom pripreme za analizu (ovisno o HPLC metodi koja se koristi) i tako može biti koncentracija analita u uzorcima koji su stvarno ubrizgani u HPLC preinačena. Mora se uzeti u obzir koncentracija analita u uzorcima provedenoj na HPLC.
Odredite otapalo u kojem ćete otopiti svoj analit kako biste stvorili kalibracijske standarde. Ovo otapalo mora biti sposobno pravilno otopiti analit u relativno širokom rasponu koncentracije (barem onoliko visok kao u uzorcima koje namjeravate testirati). Isto tako, ovo bi otapalo u idealnom slučaju trebalo biti prilično slično "mobilnoj fazi", otapalu koji se koristi za prijenos uzoraka kroz HPLC instrument.
Izračunajte količinu analita koja je potrebna za dobivanje "standardne" otopine analita. To se postiže množenjem potrebne koncentracije osnovnog standarda sa željenim volumenom. Koncentracija analita u ovoj otopini trebala bi biti najmanje 10% veća od najviše očekivane koncentracije uzorka. Ako je najviša očekivana koncentracija fruktoze u uzorku bezalkoholnog pića 8 grama / 100 mililitara, tada bi se osnovni standard mogao postići do koncentracije 10 grama fruktoze / 100 mililitara. Razuman volumen je 500 mililitara, pa bi bilo potrebno 8/100 ml x 500 ml = 40 grama fruktoze.
Izvažite potrebnu količinu analita na prikladnoj razini preciznosti. Često je prikladna vrijednost težine u gramima s preciznošću na jednu ili dvije decimale, ali za neke metode može biti potrebna veća preciznost.
Premjestite izvagani analit u odmjernu tikvicu potrebnog volumena i dodajte željeno otapalo do oznake punjenja na tikvici. Upotreba odmjerne tikvice (na primjer umjesto graduirane čaše) povećava preciznost vrijednosti standardne koncentracije zalihe. Pazite da se sav analit prenese u tikvicu; ako je potrebno, upotrijebite malo otapala.
Napravite seriju različitih razrjeđenja osnovnog standarda premještanjem poznatih količina osnovnog standarda u odmjerne tikvice, pomoću pipeta za precizan prijenos, a zatim dodavanjem otapala. Najniža standardna koncentracija trebala bi biti ispod najniže očekivane vrijednosti uzorka za analizu. U primjeru bezalkoholnih pića, ako je najniža očekivana koncentracija fruktoze u uzorku 2 grama / 100 ml, tada se može napraviti standard od 1 grama / 100 ml. To bi se postiglo deseterostrukim razrjeđivanjem osnovnog standarda. Standardne serije trebale bi sadržavati ukupno 5 ili 6 koncentracija, pa bi bila potrebna dodatna razrjeđenja da bi se proizveli standardi od možda 3, 5 i 8 grama fruktoze / ml. Sada imate niz standardnih rješenja pomoću kojih možete kalibrirati HPLC.