Elektroforeza s natrijevim dodecil sulfat-poliakrilamidnim gelom (SDS-PAGE) biokemijska je metoda identificiranja proteina u otopini. Kao što ilustriraju Mathews i suradnici u "Biokemiji", uzorci proteina prvo se stavljaju u "jamice" ili rupe na jednom kraju bloka poliakrilamidnog gela. Zatim se na gel nanosi električno polje. SDS, dodan opterećenim uzorcima, negira prirodni naboj proteina. Iz tog razloga molekularna težina proteina sama određuje brzinu migracije proteina dok se kreću kroz gel prema pozitivno nabijenom polu, napominje Bitesize Bio. Stoga će se više proteina u istom uzorku odvojiti jedni od drugih i migrirati u različite položaje.
Orijentirajte gel fotografiju. "Vrh" je mjesto jažica u koje su izvorno dodani uzorci. "Dno" je mjesto na koje su uzorci migrirali i najčešće sadrže bojilo koje označava migrirajuću frontu uzoraka. Lijevo ili desno mora sadržavati "marker", koji se koristi kao predvidljivi vodič za molekularnu težinu.
Označite uzorke za svaku traku. Preko vrha, uzorci dodani u bušotine vertikalno će migrirati u "trake". Stoga su sve šipke vidljive u okomitom stupcu došle iz jednog uzorka koji je napunjen neposredno iznad njega. Upotrijebite ravnalo i olovku za postavljanje granica na trake ako je teško vizualizirati stupce.
Označite molekularne veličine traka u marker traci. Komercijalno dostupni markeri dolaze sa slikom uzorka trake koji se očekuje zajedno s molekularnim težinama svake trake. Trake su tamne horizonalne "šipke", koje su zapravo umrljani proteini ugrađeni u gel.
Nacrtajte lagane vodoravne linije koje se protežu od svake trake markera do suprotnog ruba gela. Pazite da ove crte budu paralelne s jamicama i prednjom stranom boje. Te crte pokazuju gdje bi se proteini molekulske težine označeni svakom marker vrpcom smjestili u svakoj traci. Na primjer, traka u traci 4 koja se nalazi neposredno ispod crte produžene od 25-kilodaltona markerski pojas sugerira da je pojas trake 4 molekularno gotovo, ali ne baš 25 kilodaltona težina.
Označite svaku traku u svakoj traci s njenom procijenjenom molekulskom težinom. Koristite markere kao vodič i procjenjujte vrijednosti između veličina markera.
Ispod fotografije gela napravite popis "proteina" za svaku traku. Započnite s navođenjem onoga što je poznato o svakom uzorku, kao što je njegovo podrijetlo ili uvjeti. Zatim navedite procijenjenu molekularnu težinu svake trake u traku. Trakovi s jednom trakom pokazuju da uzorak sadrži samo jedan protein. Trakovi s više traka ukazuju na prisutnost više proteina. Opsezi koji se izvode s migracijskim frontom manji su nego što sugerira najbliži marker i vjerojatno se ne mogu predvidjeti, osim ako oznaka označava "manje od".
Na popisu proteina imajte na umu neobičnosti. "Razmazani" izgled može ukazivati da je prisutno previše proteina ili da je viskoznost uzorka utjecala na njegovu migraciju Ako se čini da trake nadilaze granicu ruba trake ili su prilično velike u usporedbi s drugim vrpcama, tada je koncentracija tog proteina vjerojatno previsoka i treba je razrijediti u budućnosti elektroforeza. Sivkasta nijansa kroz cijelu traku, tamnija od pozadinske boje gela, ukazuje na nerazlučive dijelove proteina.
Odredite identitet proteina u svakoj traci. Iako se to radi samo s molekularnom težinom, izvor svake trake vjerojatno će također naznačiti tragove. Uzmite u obzir da pod nekim uvjetima proteini mogu održavati dimere ili trimere na gelu. Stoga se jedan protein može pojaviti na gelu kao tri različita traka. Čak i ako se proteini ne mogu identificirati, relativna tamnost traka može implicirati koncentracije proteina u otopini. Bilo koji znatiželjni i nepoznati proteini mogu se izolirati izravno iz originalnog gela i poslati na identifikaciju.
Stvari koje ćete trebati
- Fotografija SDS-PAGE gela, obojena
- Ključ za upotrijebljeni marker molekularne težine
- Vladar
- Pen