Tekuća kromatografija visokih performansi tehnika je za laboratorijsku analizu smjese. To je učinkovita vrsta kromatografije koja koristi visoki tlak, a ne samo gravitaciju, za prodiranje uzorka smjese kroz kolonu. Ubrizgava se uzorak, a zatim pumpa koja sadrži velike količine pritiska pomaže pomicanju uzorka duž napunjenog stupa, gdje je odvojen na pojedinačne komponente. To razdvajanje se zatim analizira detektorom kako bi se dobili rezultati.
Mjesto ubrizgavanja
Da bi se ubrizgao u HPLC, uzorak se prvo mora otopiti u polarnom tekućem otapalu, po mogućnosti onom s poznatim HPLC spektrom, tako da se njegovi podaci mogu razlikovati od uzoraka. Tekuća otopina koja sadrži uzorak stavlja se u instrument i šalje u kolonu. Stvarno mjesto mjesta ubrizgavanja ovisi o marki instrumenata. U većini slučajeva postupak ubrizgavanja je automatiziran, ali u nekim slučajevima laboratorijski radnik mora ubrizgati uzorak pomoću male igle šprice.
Komponenta pumpe
Komponenta pumpe HPLC jedinice neophodna je jer pruža tlak koji pokreće uzorak kroz kolonu. Snaga pumpe varira, ali snažna može stvoriti tlak do 6000 psi ili kilograma po kvadratnom inču, koji se primjenjuje nakon ubrizgavanja uzorka. To omogućuje da uzorak brže i učinkovitije prolazi kroz kolonu nego da kaplje kroz samo silu gravitacije.
Opis stupca
Povećana brzina uzorka koji pumpa prolazi kroz kolonu omogućuje upotrebu drugog tipa stupa od onih koji se koriste u jednostavnoj tekućinskoj kromatografiji. Materijal za pakiranje u koloni može imati puno manju veličinu čestica, što povećava površinu i stoga pomaže interakcijama uzorka sa kolonom. Većina HPLC stupaca radi kroz polaritet. Uzorak se otopi u polarnom otapalu, a kolonu čine uglavnom nepolarni ugljikovodici. Polarni dijelovi molekule uzorka vrlo brzo prolaze kroz kolonu jer primarno stupaju u interakciju s otapalo, dok se nepolarne komponente uzorka zadržavaju u koloni, stvarajući slabe interakcije s kolonom komponente. Stoga se komponente uzorka odvajaju od stupca redoslijedom od najpolarnijih do najpolarnijih.
Funkcija detektora
Detektori se također razlikuju ovisno o vrsti HPLC instrumenta koji se koristi. Međutim, većina funkcionira na isti osnovni način. Izvor ultraljubičastog svjetla sjaji na odvojenim komponentama uzorka kako izlaze iz kolone. Većina organskih spojeva apsorbira određenu količinu svjetlosti, pa dok prolaze pored primijenjene zrake svjetlosti, detektor može pokupiti koliko se svjetlosti apsorbira. Detektor također bilježi vrijeme zadržavanja komponenata na temelju redoslijeda kojim se odvajaju od kolone. Taj se izlaz zatim može analizirati na temelju površine vrha kako bi se utvrdila točna priroda komponenata uzorka.