डीएनए क्लोनिंग: परिभाषा, प्रक्रिया, उदाहरण

डॉली भेड़ जैसे पूरे जीवों का क्लोन बनाना संभव है, लेकिन डीएनए क्लोनिंग अलग है। यह बनाने के लिए आणविक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग करता है डीएनए अनुक्रम या एकल जीन की समान प्रतियां.

आनुवंशिक इंजीनियरिंग विधियों का उपयोग करते हुए, डीएनए आनुवंशिक कोड के खंडों की पहचान की जाती है और उन्हें अलग किया जाता है। डीएनए क्लोनिंग फिर कॉपी करता है न्यूक्लिक अम्ल खंडों में अनुक्रम।

परिणामी समान प्रतियों का उपयोग आगे के शोध या जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। अक्सर कॉपी किया गया जीन एक प्रोटीन को एन्कोड करता है जो चिकित्सा उपचार का हिस्सा बन सकता है। डीएनए प्रौद्योगिकी सहित डीएनए क्लोनिंग यह समझने में सहायता कर रहा है कि जीन कैसे काम करते हैं और मनुष्यों का आनुवंशिक कोड शरीर के कामकाज को कैसे प्रभावित करता है।

डीएनए क्लोनिंग गुणसूत्रों में स्थित डीएनए खंडों की समान प्रतियां बनाने की आणविक जीव विज्ञान प्रक्रिया है जिसमें उन्नत जीवों के आनुवंशिक कोड होते हैं।

प्रक्रिया बड़ी मात्रा में उत्पन्न करती है लक्ष्य डीएनए अनुक्रम. डीएनए क्लोनिंग का उद्देश्य लक्ष्य डीएनए अनुक्रमों को स्वयं उत्पन्न करना या लक्ष्य अनुक्रमों में एन्कोडेड प्रोटीन का उत्पादन करना है।

डीएनए क्लोनिंग में प्रयुक्त दो विधियों को कहा जाता है प्लाज्मिड वेक्टर तथा पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर). में प्लाज्मिड वेक्टर विधि, डीएनए स्ट्रैंड का उपयोग करके काटा जाता है प्रतिबंधित एंजाइम डीएनए अंशों का उत्पादन करने के लिए, और परिणामी खंडों को आगे के दोहराव के लिए प्लास्मिड नामक क्लोनिंग वैक्टर में डाला जाता है। प्लास्मिड को जीवाणु कोशिकाओं में रखा जाता है जो तब डीएनए प्रतियां या एन्कोडेड प्रोटीन का उत्पादन करते हैं।

में पीसीआर विधि, डुप्लिकेट किए जाने वाले डीएनए स्ट्रैंड के खंड को एंजाइमों के साथ चिह्नित किया जाता है जिसे कहा जाता है प्राइमरों. एक पोलीमरेज़ एंजाइम डीएनए स्ट्रैंड के चिह्नित हिस्से की प्रतियां बनाता है। यह विधि प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग नहीं करती है और छोटे नमूनों से क्लोन डीएनए का उत्पादन कर सकती है। कभी-कभी समग्र प्रतिक्रिया में प्रत्येक की सर्वोत्तम विशेषताओं को शामिल करने के लिए दो डीएनए प्रौद्योगिकी विधियों का एक साथ उपयोग किया जाता है।

विधि का वेक्टर लक्ष्य डीएनए खंड को क्लोन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड को संदर्भित करता है। प्लास्मिड के छोटे गोलाकार तार होते हैं गैर-गुणसूत्र डीएनए बैक्टीरिया और वायरस सहित कई जीवों में पाया जाता है।

बैक्टीरियल प्लास्मिड वेक्टर होते हैं जिनका उपयोग लक्ष्य डीएनए सेगमेंट को आगे दोहराव के लिए बैक्टीरिया कोशिकाओं में डालने के लिए किया जाता है।

लक्ष्य डीएनए को चुनना और अलग करना: डीएनए क्लोनिंग प्रक्रिया शुरू होने से पहले, डीएनए अनुक्रमों की पहचान की जानी चाहिए, विशेष रूप से डीएनए खंडों की शुरुआत और अंत।

ऐसे डीएनए अनुक्रम ज्ञात अनुक्रमों के साथ मौजूदा क्लोन डीएनए का उपयोग करके या लक्ष्य डीएनए अनुक्रम द्वारा उत्पादित प्रोटीन का अध्ययन करके पाया जा सकता है। एक बार अनुक्रम ज्ञात हो जाने पर, संबंधित प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग किया जा सकता है।

प्रतिबंध एंजाइमों के साथ लक्ष्य डीएनए काटना: लक्ष्य अनुक्रमों की शुरुआत और अंत में डीएनए कोड देखने के लिए प्रतिबंध एंजाइमों का चयन किया जाता है।

जब प्रतिबंध एंजाइमों को आधार जोड़े का एक विशेष कोडित अनुक्रम मिलता है जिसे प्रतिबंध स्थल कहा जाता है, तो वे उस स्थान पर स्वयं को डीएनए से जोड़ लेते हैं और डीएनए अणु के चारों ओर स्वयं को घुमाते हैं, जिससे वे अलग हो जाते हैं किनारा। लक्ष्य अनुक्रम वाले कटे हुए डीएनए खंड अब दोहराव के लिए उपलब्ध हैं।

प्लाज्मिड वेक्टर चुनना और लक्ष्य डीएनए डालना: एक उपयुक्त प्लास्मिड में आदर्श रूप से वही डीएनए कोडिंग अनुक्रम होते हैं जो डीएनए स्ट्रैंड से होते हैं जिससे लक्ष्य डीएनए काटा गया था। प्लास्मिड के वृत्ताकार डीएनए स्ट्रैंड को उसी प्रतिबंध एंजाइम के साथ काटा जाता है, जिसका उपयोग लक्ष्य डीएनए को काटने के लिए किया जाता था।

ए डीएनए लिगेज एंजाइम डीएनए खंड को जोड़ने को बढ़ावा देने के लिए उपयोग किया जाता है, और लक्ष्य डीएनए खंड के सिरे प्लास्मिड डीएनए के कटे हुए सिरों के साथ जुड़ते हैं। लक्ष्य डीएनए अब वृत्ताकार प्लास्मिड डीएनए स्ट्रैंड का हिस्सा बनता है।

प्लाज्मिड को जीवाणु कोशिका में सम्मिलित करना: एक बार जब प्लास्मिड में क्लोन किए जाने वाले डीएनए अनुक्रम होते हैं, तो वास्तविक क्लोनिंग एक प्रक्रिया का उपयोग करके हो सकती है जिसे कहा जाता है जीवाणु परिवर्तन. प्लास्मिड को एक जीवाणु कोशिका में डाला जाता है जैसे कि ई। कोलाई, और नए डीएनए सेगमेंट वाली कोशिकाएं प्रतियां और संबंधित प्रोटीन का उत्पादन शुरू कर देंगी।

जीवाणु परिवर्तन में, मेजबान कोशिकाओं और प्लास्मिड को शरीर के तापमान पर लगभग 12 घंटे तक एक साथ ऊष्मायन किया जाता है। कोशिकाएं कुछ प्लास्मिड को अवशोषित करती हैं और उन्हें अपने स्वयं के प्लास्मिड डीएनए के रूप में मानती हैं।

क्लोन डीएनए और प्रोटीन की कटाई: डीएनए क्लोनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश प्लास्मिड में होते हैं एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन उनके डीएनए में शामिल जैसे ही जीवाणु कोशिकाएं नए प्लास्मिड को अवशोषित करती हैं, वे एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी बन जाती हैं।

जब संस्कृति को एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किया जाता है, तो केवल वे कोशिकाएं जीवित रहती हैं जिन्होंने नए प्लास्मिड को अवशोषित किया है। परिणाम क्लोन डीएनए के साथ जीवाणु कोशिकाओं की एक शुद्ध संस्कृति है। उस डीएनए को तब काटा जा सकता है या संबंधित प्रोटीन का उत्पादन किया जा सकता है।

पीसीआर विधि सरल है और मौजूदा डीएनए को जगह में कॉपी करती है। इसे प्रतिबंध एंजाइमों के साथ काटने या डालने की आवश्यकता नहीं है प्लाज्मिडडीएनए क्रम। यह इसे सीमित संख्या में डीएनए स्ट्रैंड वाले डीएनए नमूनों की क्लोनिंग के लिए विशेष रूप से उपयुक्त बनाता है। जबकि विधि डीएनए को क्लोन कर सकती है, इसका उपयोग संबंधित प्रोटीन के उत्पादन के लिए नहीं किया जा सकता है।

डीएनए स्ट्रैंड्स को खोलना: गुणसूत्रों में डीएनए एक डबल हेलिक्स संरचना में कसकर कुंडलित होता है। डीएनए को 96 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने की प्रक्रिया में कहा जाता है विकृतीकरण डीएनए अणु को अलग करता है और दो स्ट्रैंड में अलग करता है। यह पृथक्करण आवश्यक है क्योंकि एक समय में डीएनए के केवल एक ही स्ट्रैंड का क्लोन बनाया जा सकता है।

प्राइमरों का चयन: प्लास्मिड वेक्टर डीएनए क्लोनिंग के साथ, क्लोन किए जाने वाले डीएनए अनुक्रमों को डीएनए सेगमेंट की शुरुआत और अंत पर विशेष जोर देने के साथ पहचाना जाना चाहिए। प्राइमर एंजाइम होते हैं जो विशिष्ट डीएनए कोड अनुक्रमों से जुड़ते हैं, और उन्हें लक्षित डीएनए खंडों को चिह्नित करने के लिए चुना जाना होता है। लक्ष्य खंडों की शुरुआत और अंत को चिह्नित करने के लिए सही प्राइमर डीएनए अणु अनुक्रमों से जुड़ेंगे।

प्राइमरों को बांधने के लिए प्रतिक्रिया की घोषणा करना: प्रतिक्रिया को लगभग 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करना कहलाता है annealing. जैसे ही प्रतिक्रिया ठंडी होती है, प्राइमर सक्रिय हो जाते हैं और लक्ष्य डीएनए खंड के प्रत्येक छोर पर खुद को डीएनए स्ट्रैंड से जोड़ लेते हैं। प्राइमर केवल मार्कर के रूप में कार्य करते हैं, और डीएनए स्ट्रैंड को काटने की आवश्यकता नहीं होती है।

लक्ष्य डीएनए खंड की समान प्रतियां तैयार करना: नामक प्रक्रिया में एक्सटेंशन, गर्मी के प्रति संवेदनशील TAQ पोलीमरेज़ एंजाइम को प्रतिक्रिया में जोड़ा जाता है। फिर एंजाइम को सक्रिय करते हुए प्रतिक्रिया को 72 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है। सक्रिय डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम प्राइमरों को बांधता है और उनके बीच डीएनए अनुक्रम की प्रतिलिपि बनाता है। प्रारंभिक डीएनए अनुक्रमण और क्लोनिंग प्रक्रिया पूरी हो गई है।

क्लोन डीएनए की उपज बढ़ाना: प्रारंभिक एनीलिंग और विस्तार प्रक्रिया उपलब्ध डीएनए स्ट्रैंड सेगमेंट की अपेक्षाकृत कुछ प्रतियां बनाती है। अतिरिक्त डीएनए प्रतिकृति के माध्यम से उपज बढ़ाने के लिए, प्राइमर को फिर से सक्रिय करने के लिए प्रतिक्रिया को फिर से ठंडा किया जाता है और उन्हें अन्य डीएनए स्ट्रैंड से बांधने दिया जाता है।

फिर, प्रतिक्रिया को फिर से गर्म करने से पोलीमरेज़ एंजाइम फिर से सक्रिय हो जाता है और अधिक प्रतियां तैयार की जाती हैं। इस चक्र को 25 से 30 बार दोहराया जा सकता है।

प्लास्मिड वेक्टर विधि प्लास्मिड को काटने और डालने के लिए डीएनए की पर्याप्त प्रारंभिक आपूर्ति पर निर्भर करती है। बहुत कम मूल डीएनए के परिणामस्वरूप कम प्लास्मिड होते हैं और क्लोन डीएनए उत्पादन की धीमी शुरुआत होती है।

पीसीआर विधि कुछ मूल डीएनए स्ट्रैंड से बड़ी मात्रा में डीएनए का उत्पादन कर सकती है, लेकिन चूंकि डीएनए एक जीवाणु कोशिका में प्रत्यारोपित नहीं होता है, इसलिए प्रोटीन का उत्पादन संभव नहीं है।

एक छोटे से प्रारंभिक डीएनए नमूने से क्लोन किए जाने वाले डीएनए टुकड़ों में एन्कोडेड प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए, दो विधियों का एक साथ उपयोग किया जा सकता है, और वे कर सकते हैं एक दूसरे की पूर्ति करना। सबसे पहले पीसीआर पद्धति का उपयोग एक छोटे से नमूने से डीएनए को क्लोन करने और कई प्रतियां तैयार करने के लिए किया जाता है।

फिर पीसीआर उत्पादों का उपयोग प्लास्मिड वेक्टर विधि के साथ उत्पादित डीएनए को बैक्टीरिया कोशिकाओं में प्रत्यारोपित करने के लिए किया जाता है जो वांछित प्रोटीन का उत्पादन करेंगे।

आणविक जीव विज्ञान चिकित्सा और व्यावसायिक उद्देश्यों के लिए जीन क्लोनिंग और डीएनए प्रतिकृति का उपयोग करता है। क्लोन डीएनए अनुक्रम वाले बैक्टीरिया का उपयोग दवाओं का उत्पादन करने और उन पदार्थों को बदलने के लिए किया जाता है जिन्हें आनुवंशिक विकार वाले लोग स्वयं उत्पन्न नहीं कर सकते हैं।

विशिष्ट उपयोगों में शामिल हैं:

• के लिए जीन मानव इंसुलिन बैक्टीरिया में क्लोन किया जाता है जो तब मधुमेह रोगियों द्वारा उपयोग किए जाने वाले इंसुलिन का उत्पादन करता है।
• ऊतक प्लास्मिनोजेन उत्प्रेरक क्लोन डीएनए से उत्पन्न होता है और मदद करने के लिए उपयोग किया जाता है रक्त के थक्कों को रोकें.
• मानव विकास हार्मोन उन लोगों को उत्पादित और प्रशासित किया जा सकता है जो स्वयं इसका उत्पादन नहीं कर सकते।

जैव प्रौद्योगिकी पौधों और जानवरों में नई विशेषताओं को बनाने या मौजूदा विशेषताओं को बढ़ाने के लिए कृषि में जीन क्लोनिंग का भी उपयोग करती है। जैसे-जैसे अधिक जीन क्लोन किए जाते हैं, संभावित उपयोगों की संख्या तेजी से बढ़ती है।

डीएनए अणु एक जीवित कोशिका में सामग्री का एक छोटा सा अंश बनाते हैं, और कई जीनों के प्रभावों को अलग करना मुश्किल होता है। डीएनए क्लोनिंग के तरीके अध्ययन के लिए एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम की बड़ी मात्रा में वितरित करते हैं, और डीएनए प्रोटीन का उत्पादन कर रहा है जैसा कि मूल सेल में हुआ था। डीएनए क्लोनिंग अलग-अलग जीनों के लिए अलगाव में इस ऑपरेशन का अध्ययन करना संभव बनाता है।

विशिष्ट अनुसंधान और डीएनए प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में जांच शामिल है:

• एक जीन का कार्य।
• एक जीन के उत्परिवर्तन।
• जीन अभिव्यक्ति।
• जीन उत्पाद।
• आनुवंशिक दोष।

जब अधिक डीएनए अनुक्रमों को क्लोन किया जाता है, तो अतिरिक्त अनुक्रमों को खोजना और क्लोन करना आसान होता है। मौजूदा क्लोन डीएनए खंडों का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या एक नया खंड पुराने से मेल खाता है और कौन से हिस्से अलग हैं। लक्ष्य डीएनए अनुक्रम की पहचान करना तब तेज़ और अधिक सटीक होता है।

में जीन थेरेपी, एक क्लोन जीन एक जीव की कोशिकाओं को प्रस्तुत किया जाता है जिसका प्राकृतिक जीन क्षतिग्रस्त हो जाता है। एक महत्वपूर्ण जीन जो एक विशिष्ट जीव कार्य के लिए आवश्यक प्रोटीन का उत्पादन करता है, उत्परिवर्तित, विकिरण द्वारा परिवर्तित या वायरस से प्रभावित हो सकता है।

जब जीन ठीक से काम नहीं करता है, तो कोशिका से एक महत्वपूर्ण पदार्थ गायब हो जाता है। जीन थेरेपी की कोशिश करता है जीन को एक क्लोन संस्करण के साथ बदलें जो आवश्यक पदार्थ का उत्पादन करेगा.

जीन थेरेपी अभी भी प्रायोगिक है, और तकनीक का उपयोग करके कुछ रोगियों को ठीक किया गया है। समस्या एक चिकित्सा स्थिति के लिए जिम्मेदार एकल जीन की पहचान करने और जीन की कई प्रतियों को सही कोशिकाओं तक पहुंचाने में निहित है। चूंकि डीएनए क्लोनिंग अधिक व्यापक हो गई है, इसलिए कई विशिष्ट स्थितियों में जीन थेरेपी को लागू किया गया है।

हाल के सफल अनुप्रयोगों में शामिल हैं:

• पार्किंसंस रोग: एक वेक्टर के रूप में एक वायरस का उपयोग करते हुए, पार्किंसंस रोग से संबंधित जीन को रोगियों के मध्य मस्तिष्क में इंजेक्ट किया गया था। मरीजों ने बिना किसी प्रतिकूल दुष्प्रभाव के बेहतर मोटर कौशल का अनुभव किया।
• एडेनोसाइन डेमिनमिनस (एडीए) की कमी: रोगियों के रक्त स्टेम कोशिकाओं को हटाकर और एडीए जीन डालने से आनुवंशिक प्रतिरक्षा विकार का इलाज किया गया था। परिणामस्वरूप मरीज कम से कम अपने स्वयं के एडीए का उत्पादन करने में सक्षम थे।
• हीमोफीलिया: हीमोफिलिया वाले लोग विशिष्ट प्रोटीन का उत्पादन नहीं करते हैं जो रक्त के थक्के में मदद करते हैं। रोगियों के यकृत कोशिकाओं में लापता प्रोटीन में से एक के उत्पादन के लिए एक जीन डाला गया था। मरीजों ने प्रोटीन का उत्पादन किया और रक्तस्राव की घटनाओं को कम किया गया।

जीन थेरेपी डीएनए क्लोनिंग के सबसे आशाजनक अनुप्रयोगों में से एक है, लेकिन अन्य नए उपयोगों के बढ़ने की संभावना है क्योंकि अधिक डीएनए अनुक्रमों का अध्ययन किया जाता है और उनका कार्य निर्धारित होता है। डीएनए क्लोनिंग जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए आवश्यक मात्रा में कच्चा माल पहुंचाती है।

जब जीन की भूमिका ज्ञात हो और दोषपूर्ण के प्रतिस्थापन के माध्यम से उनके उचित कार्य को सुनिश्चित किया जा सके डीएनए का उपयोग करके आनुवंशिक स्तर पर जीन, कई पुरानी बीमारियों और यहां तक ​​कि कैंसर पर भी हमला और इलाज किया जा सकता है प्रौद्योगिकी।

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