आणविक जीव विज्ञान में, विभिन्न डीएनए अलगाव चरणों के लिए अच्छा बफर विकल्प और तैयारी हो सकती है प्रोटीन अभिव्यक्ति पर आगे बढ़ने या शुरू करने के लिए एक और मैक्सी-प्रीप किट खोलने के बीच का अंतर ऊपर। उनके महत्वपूर्ण महत्व के बावजूद, बफर रेसिपी अक्सर बस यही होती हैं-विभिन्न घटकों के लिए स्पष्टीकरण या तर्क के बिना लिखी जाने वाली रेसिपी। ऐसा ही एक बफर ग्लूकोज-ट्रिस-ईडीटीए या जीटीई बफर है।
जीटीई किसके लिए प्रयोग किया जाता है?
GTE का उपयोग बैक्टीरियल सेल छर्रों को फिर से निलंबित करने के लिए किया जाता है ताकि कोशिकाओं को लिसिंग (खुला तोड़) और अंदर प्लास्मिड डीएनए की कटाई की जा सके। लाइसोजाइम, जो कोशिका झिल्ली को नरम करता है, अक्सर जीटीई बफर के साथ जोड़ा जाता है। इस चरण के दौरान पूरे कोशिकाओं के समरूप निलंबन को प्राप्त करना ताकि बाद में जोड़ा गया लसीका समाधान सभी कोशिकाओं को मिल सके, अच्छी डीएनए पैदावार प्राप्त करने की कुंजी है। GTE को डीएनए के लिए एक स्थिर वातावरण प्रदान करते हुए ऐसा करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
ऑस्मोलैरिटी के लिए ग्लूकोज
50mM (मिलीमोलर) ग्लूकोज चीनी को परासरण बनाए रखने के लिए GTE बफर में जोड़ा जाता है जहां कोशिकाओं के बाहर विलेय सांद्रता कोशिकाओं के अंदर के करीब होती है। यह समयपूर्व कोशिका लसीका को रोकता है, जो एकत्रीकरण और गिरावट के कारण कम डीएनए पैदावार का कारण बन सकता है। बफर के अन्य घटक भी घोल के परासरण में योगदान करते हैं, लेकिन ग्लूकोज, एक गैर-इलेक्ट्रोलाइट होने के नाते, एक अच्छा विकल्प है क्योंकि यह समाधान के बफर में हस्तक्षेप नहीं करता है गुण।
पीएच स्थिरता के लिए ट्रिस
ट्रिस ट्रिस (हाइड्रॉक्सीमेथाइल) एमिनोमिथेन का संक्षिप्त नाम है, जो एक बहुत ही सामान्य पीएच बफर है। जीटीई बफर के मामले में, एसिड नमक (ट्रिस-एचसीएल) को बफर में 25 एमएम की एकाग्रता में जोड़ा जाता है। यह समाधान के पीएच को लगभग शारीरिक 8.0 पर बनाए रखता है, प्लास्मिड डीएनए के एसिड हाइड्रोलिसिस (गिरावट) और अन्य सेल घटकों के अवांछित पक्ष प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए एक आदर्श पीएच।
EDTA डीएनए क्षरण को रोकता है
EDTA, या ethylenediaminetetraacetic एसिड, धातु आयनों को घोल से बाहर निकालता है या "चेलेट्स" करता है, जिससे उन्हें अवांछित पक्ष प्रतिक्रियाओं में भाग लेने से रोका जाता है। GTE बफ़र में, EDTA को 10mM पर जोड़ा जाता है। इसका प्राथमिक उद्देश्य बफर में मुक्त जस्ता, मैग्नीशियम और कैल्शियम को गोल करना है, जिससे उन धातुओं की आवश्यकता वाले कुछ मार्गों से डीएनए क्षरण को रोका जा सके।
कुछ महत्वपूर्ण टिप्स
अपने जीटीई बफर को ठंडा रखें और उसमें अवांछित बैक्टीरिया के विकास को रोकने के लिए इसे कम मात्रा में बनाएं। चीनी और नियंत्रित पीएच एक महान विकास माध्यम बनाते हैं। हमेशा शुद्ध पानी का ही प्रयोग करें। नल के पानी में पाइप से धातु आयनों की अधिकता हो सकती है, जो EDTA को पकड़ने की क्षमता को प्रभावित कर सकता है। यदि आपको अपने नमूने में आरएनए के हस्तक्षेप की उपस्थिति का संदेह है, तो समस्या को खत्म करने के लिए अपने जीटीई बफर में 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर पर RNase A जोड़ें।