आणविक क्लोनिंग एक सामान्य जैव प्रौद्योगिकी पद्धति है जिससे प्रत्येक छात्र और शोधकर्ता को परिचित होना चाहिए। मानव डीएनए को टुकड़ों में काटने के लिए एक प्रकार के एंजाइम का उपयोग करके आणविक क्लोनिंग को प्रतिबंध एंजाइम कहा जाता है जिसे बाद में एक जीवाणु कोशिका के प्लास्मिड डीएनए में डाला जा सकता है। प्रतिबंधन एंजाइम डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को आधा कर देते हैं। प्रतिबंध एंजाइम के आधार पर, कट का परिणाम चिपचिपा अंत या कुंद अंत हो सकता है। आणविक क्लोनिंग में चिपचिपे सिरे अधिक उपयोगी होते हैं क्योंकि वे सुनिश्चित करते हैं कि मानव डीएनए टुकड़ा प्लास्मिड में सही दिशा में डाला गया है। जब डीएनए के चिपचिपे सिरे होते हैं, तो बंधाव प्रक्रिया, या डीएनए अंशों के फ्यूज़िंग को कम डीएनए की आवश्यकता होती है। अंत में, कई चिपचिपा अंत प्रतिबंध एंजाइम एक ही चिपचिपा अंत उत्पन्न कर सकते हैं, भले ही प्रत्येक एंजाइम एक अलग प्रतिबंध अनुक्रम को पहचानता हो। इससे इस बात की संभावना बढ़ जाती है कि आपकी रुचि के डीएनए क्षेत्र को चिपचिपे अंत एंजाइमों द्वारा काटा जा सकता है।
प्रतिबंध एंजाइम और प्रतिबंध साइटें
प्रतिबंध एंजाइम एंजाइम होते हैं जो डबल-फंसे डीएनए पर विशिष्ट अनुक्रमों को काटते हैं और उस क्रम में डीएनए को आधे में काटते हैं। मान्यता प्राप्त अनुक्रम को प्रतिबंध स्थल कहा जाता है। प्रतिबंध एंजाइमों को एंडोन्यूक्लिअस कहा जाता है क्योंकि वे डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को काटते हैं, जो कि डीएनए के सिरों के बीच के स्थानों पर डीएनए सामान्य रूप से मौजूद होता है। 90 से अधिक विभिन्न प्रतिबंध एंजाइम हैं। प्रत्येक एक अलग प्रतिबंध साइट को पहचानता है। प्रतिबंध एंजाइम अपने संबंधित प्रतिबंध साइटों को अन्य साइटों की तुलना में 5,000 गुना अधिक कुशलता से साफ करते हैं जिन्हें वे नहीं पहचानते हैं।
सही अभिविन्यास
प्रतिबंध एंजाइम दो सामान्य वर्गों में आते हैं। वे या तो डीएनए को चिपचिपे सिरों में काटते हैं या कुंद सिरे। एक चिपचिपे सिरे में न्यूक्लियोटाइड्स का एक छोटा क्षेत्र होता है, जो डीएनए के निर्माण खंड होते हैं, जो कि अयुग्मित होता है। इस अयुग्मित क्षेत्र को ओवरहांग कहा जाता है। ओवरहांग को चिपचिपा कहा जाता है क्योंकि यह चाहता है और एक और चिपचिपा अंत के साथ जोड़ देगा जिसमें पूरक ओवरहांग अनुक्रम है। चिपचिपे सिरे लंबे समय से खोए हुए जुड़वा बच्चों की तरह होते हैं जो एक बार मिलने के बाद एक-दूसरे को कसकर गले लगाना चाहते हैं। दूसरी ओर, कुंद सिरे चिपचिपे नहीं होते हैं क्योंकि सभी न्यूक्लियोटाइड पहले से ही डीएनए के दो स्ट्रैंड के बीच जोड़े जाते हैं। चिपचिपे सिरे का लाभ यह है कि मानव डीएनए का एक टुकड़ा केवल एक दिशा में एक जीवाणु प्लास्मिड में फिट हो सकता है। इसके विपरीत, यदि मानव डीएनए और जीवाणु प्लास्मिड दोनों के कुंद सिरे हैं, तो मानव डीएनए को प्लास्मिड में सिर से पूंछ या पूंछ से सिर तक डाला जा सकता है।
लिगेटिंग स्टिकी एंड्स के लिए कम डीएनए की आवश्यकता होती है
हालांकि स्टिक सिरों वाले डीएनए को उनकी "चिपचिपाहट" के कारण एक-दूसरे को खोजने में आसानी होती है, लेकिन न तो चिपचिपे सिरे और न ही कुंद सिरे एक साथ डीएनए के निरंतर टुकड़े में फ्यूज हो सकते हैं। पूरी तरह से जुड़े डीएनए के एक निरंतर टुकड़े के निर्माण के लिए एक एंजाइम की आवश्यकता होती है जिसे लिगेज कहा जाता है। लिगैस न्यूक्लियोटाइड्स की रीढ़ को चिपचिपे या कुंद सिरों पर जोड़ते हैं, जिसके परिणामस्वरूप न्यूक्लियोटाइड्स की एक सतत श्रृंखला होती है। चूंकि चिपचिपे सिरे एक-दूसरे के प्रति आकर्षण के कारण एक-दूसरे को तेजी से ढूंढते हैं, बंधाव की प्रक्रिया में कम मानव डीएनए और कम प्लास्मिड डीएनए की आवश्यकता होती है। डीएनए और प्लास्मिड के कुंद सिरों के एक दूसरे को खोजने की संभावना कम होती है, और इस प्रकार कुंद सिरों के बंधन के लिए टेस्ट ट्यूब में अधिक डीएनए डालने की आवश्यकता होती है।
विभिन्न एंजाइम एक ही चिपचिपा अंत दे सकते हैं
प्रतिबंध स्थल जीवों के पूरे जीनोम में स्थित होते हैं, लेकिन समान रूप से दूरी नहीं रखते हैं। प्लास्मिड में, उन्हें एक दूसरे के ठीक बगल में स्थित होने के लिए इंजीनियर बनाया जा सकता है। वैज्ञानिक जो मानव जीनोम से मानव डीएनए के एक टुकड़े को काटना चाहते हैं, उन्हें उन प्रतिबंध स्थलों को खोजना होगा जो खंड के क्षेत्र के सामने और पीछे हों। यह सुनिश्चित करने के अलावा कि एक डीएनए टुकड़ा सही दिशा में डाला गया है, विभिन्न चिपचिपा अंत एंजाइम एक ही चिपचिपा अंत बना सकते हैं, भले ही वे विभिन्न प्रतिबंध अनुक्रमों को पहचानते हों। उदाहरण के लिए, BAMHI, BglII, और Sau3A में अलग-अलग मान्यता अनुक्रम हैं, लेकिन एक ही GATC चिपचिपा अंत उत्पन्न करते हैं। इससे संभावना बढ़ जाती है कि चिपचिपा अंत प्रतिबंध साइटें होंगी जो आपकी रुचि के मानव जीन को झुकाती हैं।
