एक कोशिका का आनुवंशिक खाका उसकी आनुवंशिक सामग्री, या डीएनए के भीतर एन्कोड किया जाता है। चूंकि डीएनए कोशिका के केंद्रक को कभी नहीं छोड़ता है, ताकि इस जानकारी को साइटोप्लाज्म में ले जाया जा सके जहां अन्य प्रोटीन और जैव रासायनिक घटक रहते हैं, पहले डीएनए को मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए या पॉली .) में ट्रांसक्रिप्ट करना आवश्यक है (ए) आरएनए)। यह एमआरएनए तब प्रोटीन में अनुवादित हो जाता है जो कोशिका के कई कार्यों को पूरा करता है। बहुत दुर्लभ एमआरएनए का पता लगाने या मात्रा निर्धारित करने के लिए, माइक्रोएरे के लिए जांच करें या पूरक डीएनए अणुओं के पुस्तकालयों का निर्माण करें, एमआरएनए को अलग किया जाना चाहिए। हालांकि, कुल आरएनए (यानी एक सेल में सभी आरएनए) निष्कर्षण और बाद में एमआरएनए अलगाव परस्पर अनन्य प्रक्रियाएं नहीं हैं; एमआरएनए निकालने के लिए पूर्व का प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
TRIzol समरूपीकरण: कुल RNA में सभी mRNA, स्थानांतरण RNA, राइबोसोमल RNA और अन्य गैर-कोडिंग शामिल हैं आरएनए। इन्हें अन्य सेल्युलर घटकों से अलग करने के लिए, सेल को सबसे पहले फटा जाता है ताकि वह मुक्त हो सके सामग्री। यह TRIzol अभिकर्मक (लाइफ टेक्नोलॉजीज) में सेंट्रीफ्यूजिंग (उच्च गति पर कताई) द्वारा पेलेटेड कोशिकाओं को फिर से निलंबित करके किया जाता है। TRIzol के अन्य संस्करण (जैसे Ambion's TRI Reagent) इसी तरह काम करते हैं।
कुल आरएनए अलगाव: निलंबन के भीतर, सेल के विभिन्न घटकों (प्रोटीन, डीएनए, आरएनए) को परतों, या चरणों में अलग करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन की एक श्रृंखला का उपयोग किया जाता है। शीर्ष, पीले रंग का चरण वसा से बना होता है और इसे त्याग दिया जा सकता है। वांछित चरण लाल रंग का है, इसमें कुल आरएनए होता है और इसे बरकरार रखा जाता है। फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और आइसोप्रोपेनॉल और इथेनॉल का उपयोग करके अल्कोहल वॉश की एक श्रृंखला करने के बाद, आरएनए को एमआरएनए अलगाव के लिए पिलाया जा सकता है। इस एंजाइम को कुल आरएनए को अवक्रमित करने से रोकने के लिए RNase अवरोधक जोड़ें।
एमआरएनए एक्सट्रैक्शन: एमआरएनए को अलग करने के लिए किट का उपयोग करना आम बात है, क्योंकि होममेड लैब प्रोटोकॉल बड़ी मात्रा में उत्पन्न नहीं करते हैं अत्यधिक शुद्ध mRNAs। वाणिज्यिक किट में इंविट्रोजन का फास्टट्रैक 2.0 या एंबियन का पॉली (ए) शुद्ध एमआरएनए अलगाव शामिल है किट। ये बुनियादी कदम ऐसी किट के लिए सामान्य हैं:
डी) इस नमूने को अपकेंद्रित्र करें और सतह पर तैरनेवाला पुनर्प्राप्त करें, जिसे किट में प्रदान किए गए बाध्यकारी और कम नमक बफर की एक श्रृंखला में कई बार धोया जाता है।
संदर्भ
- "सीडीएनए लाइब्रेरी प्रोटोकॉल?"; इयान जी. कोवेल और कैरोलिन ए। ऑस्टिन; 1997
- "इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन और ट्रांसलेशन प्रोटोकॉल?"; मार्टिन जे. टायम्स; 1995
टिप्स
- सभी अभिकर्मकों, कोशिकाओं और आरएनए को बर्फ में डुबो कर ठंडा रखें। यह आरएनए को किसी अन्य एंजाइम द्वारा अवक्रमित होने से रोकता है जो समरूपीकरण प्रक्रिया के दौरान जारी हो जाते हैं।
चेतावनी
- TRIzol जैसे अभिकर्मक जहरीले होते हैं और त्वचा या श्लेष्मा झिल्ली के संपर्क में नहीं होने चाहिए। इस अभिकर्मक को संभालते समय हमेशा सुरक्षित लैब प्रोटोकॉल का पालन करें।
लेखक के बारे में
Palmer Owyoung ने सैन डिएगो में कैलिफ़ोर्निया विश्वविद्यालय से अंतर्राष्ट्रीय व्यापार में मास्टर ऑफ़ आर्ट्स की उपाधि प्राप्त की है और a सांता बारबरा में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय से समाजशास्त्र में कला स्नातक और एक प्रशिक्षित आणविक है जीवविज्ञानी वह 2006 से स्वतंत्र लेखक हैं। लेखन के अलावा, वह एक पूर्णकालिक विदेशी मुद्रा व्यापारी और इंटरनेट बाज़ारिया है।
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