उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) के साथ काम करते समय, विश्वसनीय, गुणवत्ता परिणाम सुनिश्चित करने के लिए अच्छा अंशांकन नितांत आवश्यक है। एचपीएलसी उपकरण का उचित अंशांकन एक उपयुक्त अंशांकन मानक के निर्माण के साथ शुरू होता है। ज्यादातर मामलों में, अंशांकन को वास्तव में अंशांकन वक्र के रूप में जाना जाने वाला उत्पादन करने के लिए बढ़ती एकाग्रता के मानकों की एक श्रृंखला की आवश्यकता होती है। यह एक प्लॉटेड लाइन और संबद्ध समीकरण है जो परीक्षण किए जा रहे रसायन की एकाग्रता और एचपीएलसी डिटेक्टर की प्रतिक्रिया के बीच संबंध का वर्णन करता है।
उस रसायन का निर्धारण करें जिसे आप एचपीएलसी ("विश्लेषण") का उपयोग करने के लिए परीक्षण करना चाहते हैं। उदाहरण के लिए, आप फ्रुक्टोज सामग्री के लिए शीतल पेय की एक श्रृंखला का परीक्षण करना चाह सकते हैं, इस मामले में फ्रुक्टोज विश्लेषण होगा।
उपयुक्त शुद्धता के विश्लेषणात्मक रसायन की मात्रा प्राप्त करें। आम तौर पर शुद्धता 99% से ऊपर होनी चाहिए और विश्लेषण एक प्रतिष्ठित रासायनिक आपूर्ति कंपनी से खरीदा जाना चाहिए। फ्रुक्टोज के मामले में, उदाहरण के लिए, आप एक रासायनिक विक्रेता से शुद्ध फ्रुक्टोज खरीदेंगे, न कि किराने की दुकान से।
एचपीएलसी पर आपके द्वारा परीक्षण किए जाने वाले नमूनों में विश्लेषण की अधिकतम और न्यूनतम प्रत्याशित सांद्रता निर्धारित करें। शीतल पेय के मामले में, आप पेय पदार्थों के लेबल की जांच करेंगे और आपके द्वारा परीक्षण किए जाने वाले पेयों में सबसे कम और उच्चतम फ्रुक्टोज सामग्री निर्धारित करेंगे। ध्यान रखें कि प्रारंभिक नमूना (शीतल पेय) विश्लेषण की तैयारी के दौरान पतला या अन्यथा हेरफेर किया जा सकता है (एचपीएलसी विधि के उपयोग के आधार पर) और इसलिए एचपीएलसी पर वास्तव में इंजेक्ट किए गए नमूनों में विश्लेषण एकाग्रता हो सकती है संशोधित। यह एचपीएलसी पर चलने वाले नमूनों में विश्लेषण एकाग्रता है जिस पर विचार किया जाना चाहिए।
उस विलायक का निर्धारण करें जिसमें आप अंशांकन मानकों को बनाने के लिए अपने विश्लेषण को भंग कर देंगे। यह विलायक एकाग्रता की अपेक्षाकृत विस्तृत श्रृंखला पर विश्लेषण को ठीक से भंग करने में सक्षम होना चाहिए (कम से कम उन नमूनों में जितना आप परीक्षण करना चाहते हैं)। साथ ही, यह विलायक आदर्श रूप से "मोबाइल चरण:" के समान होना चाहिए, जिसका उपयोग एचपीएलसी उपकरण के माध्यम से नमूने ले जाने के लिए किया जाता है।
विश्लेषण का "स्टॉक मानक" समाधान बनाने के लिए आवश्यक विश्लेषण की मात्रा की गणना करें। यह वांछित मात्रा से स्टॉक मानक की आवश्यक एकाग्रता को गुणा करके पाया जाता है। इस समाधान में विश्लेषक की एकाग्रता उच्चतम प्रत्याशित नमूना एकाग्रता से कम से कम 10% अधिक होनी चाहिए। यदि शीतल पेय के नमूने में सबसे अधिक प्रत्याशित फ्रुक्टोज सांद्रता 8 ग्राम/100 मिलीलीटर है, तो स्टॉक मानक 10 ग्राम फ्रुक्टोज/100 मिलीलीटर की एकाग्रता में बनाया जा सकता है। एक उचित मात्रा 500 मिलीलीटर है, इस प्रकार 8/100 एमएल x 500 एमएल = 40 ग्राम फ्रुक्टोज की आवश्यकता होगी।
विश्लेषण की आवश्यक मात्रा को सटीकता के उपयुक्त स्तर तक तौलें। अक्सर एक या दो दशमलव स्थानों के लिए सटीक ग्राम में वजन मान उपयुक्त होता है, लेकिन कुछ विधियों के लिए अधिक सटीकता आवश्यक हो सकती है।
तौलने वाले विश्लेषण को आवश्यक मात्रा के वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में स्थानांतरित करें और फ्लास्क पर भरने के निशान में वांछित विलायक जोड़ें। वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क का उपयोग (उदाहरण के लिए, स्नातक किए गए बीकर के बजाय) स्टॉक मानक एकाग्रता मूल्य की सटीकता को बढ़ाता है। सुनिश्चित करें कि सभी विश्लेषण फ्लास्क में स्थानांतरित हो गए हैं; यदि आवश्यक हो तो इसे धोने के लिए कुछ विलायक का उपयोग करें।
स्टॉक मानक के ज्ञात संस्करणों को वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में स्थानांतरित करके, सटीक हस्तांतरण के लिए पिपेट का उपयोग करके, फिर विलायक जोड़कर स्टॉक मानक के अलग-अलग कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला बनाएं। न्यूनतम मानक सांद्रता विश्लेषण किए जाने वाले न्यूनतम प्रत्याशित नमूने से कम होनी चाहिए। शीतल पेय के उदाहरण में, यदि नमूने में सबसे कम अपेक्षित फ्रुक्टोज सांद्रता 2 ग्राम/100 एमएल है, तो 1 ग्राम/100 एमएल मानक बनाया जा सकता है। यह स्टॉक मानक के दस गुना कमजोर पड़ने से बनाया जाएगा। मानक श्रृंखला में कुल 5 या 6 सांद्रता शामिल होनी चाहिए, इसलिए शायद 3, 5 और 8 ग्राम फ्रुक्टोज/एमएल के मानकों का उत्पादन करने के लिए अतिरिक्त कमजोर पड़ने की आवश्यकता होगी। अब आपके पास मानक समाधानों की एक श्रृंखला है जिसके साथ एचपीएलसी को जांचना है।
