Clonage d'ADN: définition, processus, exemples

Il est possible de cloner des organismes entiers comme Dolly la brebis, mais le clonage d'ADN est différent. Il utilise des techniques de biologie moléculaire pour copies identiques de séquences d'ADN ou de gènes uniques.

À l'aide de méthodes de génie génétique, des segments du code génétique de l'ADN sont identifiés et isolés. Le clonage d'ADN copie ensuite le acide nucléique séquences dans les segments.

Les copies identiques résultantes peuvent être utilisées pour des recherches ultérieures ou pour des applications biotechnologiques. Souvent, le gène qui est copié code pour une protéine qui peut faire partie de traitements médicaux. technologie de l'ADN, y compris Clonage d'ADN soutient la compréhension du fonctionnement des gènes et de la façon dont le code génétique des humains influence le fonctionnement du corps.

Le clonage d'ADN est le processus de biologie moléculaire consistant à faire des copies identiques de segments d'ADN situés dans les chromosomes qui contiennent le code génétique d'organismes avancés.

Le processus génère de grandes quantités de séquences d'ADN cibles. Le clonage d'ADN a pour but de produire les séquences d'ADN cibles elles-mêmes ou de produire les protéines codées dans les séquences cibles.

Les deux méthodes utilisées dans le clonage d'ADN sont appelées vecteur plasmidique et réaction en chaîne par polymérase (PCR). Dans le vecteur plasmidique méthode, les brins d'ADN sont coupés à l'aide les enzymes de restriction pour produire des fragments d'ADN, et les segments résultants sont insérés dans des vecteurs de clonage appelés plasmides pour une duplication ultérieure. Les plasmides sont placés dans des cellules bactériennes qui produisent ensuite les copies d'ADN ou les protéines codées.

Dans le Méthode PCR, le segment de brins d'ADN à dupliquer est marqué avec des enzymes appelées amorces. Une enzyme polymérase fait des copies de la partie marquée du brin d'ADN. Cette méthode n'utilise pas d'enzymes de restriction et peut produire de l'ADN cloné à partir de petits échantillons. Parfois, les deux méthodes de technologie de l'ADN sont utilisées ensemble pour incorporer les meilleures caractéristiques de chacune dans une réaction globale.

Le vecteur de la méthode fait référence au plasmide utilisé pour contenir le segment d'ADN cible à cloner. Les plasmides sont de petits brins circulaires de ADN non chromosomique trouvé dans de nombreux organismes, y compris les bactéries et les virus.

Les plasmides bactériens sont le vecteur utilisé pour insérer le segment d'ADN cible dans les cellules bactériennes pour une duplication ultérieure.

Sélection et isolement de l'ADN cible : Avant que le processus de clonage d'ADN puisse commencer, les séquences d'ADN doivent être identifiées, en particulier les débuts et les extrémités des segments d'ADN.

De telles séquences d'ADN peuvent être trouvées en utilisant de l'ADN cloné existant avec des séquences connues ou en étudiant la protéine produite par la séquence d'ADN cible. Une fois la séquence connue, les enzymes de restriction correspondantes peuvent être utilisées.

Couper l'ADN cible avec des enzymes de restriction : Les enzymes de restriction sont sélectionnées pour rechercher le code ADN au début et à la fin des séquences cibles.

Lorsque les enzymes de restriction trouvent une séquence codée spéciale de paires de bases appelées sites de restriction, elles s'attachent à l'ADN à cet endroit et s'enroulent autour de la molécule d'ADN, coupant le brin. Les segments d'ADN coupés contenant la séquence cible sont désormais disponibles pour la duplication.

Choix du vecteur plasmidique et insertion de l'ADN cible : Un plasmide approprié contient idéalement les mêmes séquences codantes d'ADN que le brin d'ADN à partir duquel l'ADN cible a été coupé. Le brin d'ADN circulaire du plasmide est coupé avec les mêmes enzymes de restriction que celles utilisées pour couper l'ADN cible.

UNE enzyme ADN ligase est utilisé pour favoriser la liaison du segment d'ADN, et les extrémités du segment d'ADN cible se lient aux extrémités coupées de l'ADN plasmidique. L'ADN cible fait maintenant partie du brin d'ADN plasmidique circulaire.

Insertion du plasmide dans une cellule bactérienne : Une fois que le plasmide contient la séquence d'ADN à cloner, le clonage proprement dit peut avoir lieu en utilisant un processus appelé transformation bactérienne. Les plasmides sont insérés dans une cellule bactérienne telle que E. coli, et les cellules avec les nouveaux segments d'ADN commenceront à produire des copies et les protéines correspondantes.

Dans la transformation bactérienne, les cellules hôtes et les plasmides sont incubés ensemble à température corporelle pendant environ 12 heures. Les cellules absorbent certains des plasmides et les traitent comme leur propre ADN plasmidique.

Récolte de l'ADN et des protéines clonés : La plupart des plasmides utilisés pour le clonage d'ADN ont gènes de résistance aux antibiotiques incorporés dans leur ADN. Au fur et à mesure que les cellules bactériennes absorbent les nouveaux plasmides, elles deviennent résistantes aux antibiotiques.

Lorsque la culture est traitée avec des antibiotiques, seules les cellules qui ont absorbé les nouveaux plasmides survivent. Le résultat est une culture pure de cellules bactériennes avec de l'ADN cloné. Cet ADN peut ensuite être récolté ou la protéine correspondante peut être produite.

le PCR La méthode est plus simple et copie l'ADN existant en place. Il ne nécessite pas de couper avec des enzymes de restriction ou d'insérer plasmideADN séquences. Cela le rend particulièrement adapté au clonage d'échantillons d'ADN avec un nombre limité de brins d'ADN. Bien que la méthode puisse cloner l'ADN, elle ne peut pas être utilisée pour la production de la protéine correspondante.

Dérouler les brins d'ADN : L'ADN dans les chromosomes est étroitement enroulé dans une structure en double hélice. Chauffer l'ADN à 96 degrés Celsius dans un processus appelé dénaturation fait que la molécule d'ADN se déroule et se sépare en deux brins. Cette séparation est nécessaire car un seul brin d'ADN peut être cloné à la fois.

Sélection des amorces : Comme pour le clonage d'ADN de vecteur plasmidique, les séquences d'ADN à cloner doivent être identifiées avec un accent particulier sur les débuts et les extrémités des segments d'ADN. Les amorces sont des enzymes qui se fixent à des séquences de code d'ADN spécifiques, et elles doivent être sélectionnées pour marquer les segments d'ADN cibles. Les bonnes amorces s'attacheront aux séquences de molécules d'ADN pour marquer les débuts et les fins des segments cibles.

Recuit de la réaction pour lier les amorces : Refroidir la réaction à environ 55 degrés Celsius est appelé recuit. Lorsque la réaction se refroidit, les amorces sont activées et se fixent au brin d'ADN à chaque extrémité d'un segment d'ADN cible. Les amorces n'agissent que comme des marqueurs et le brin d'ADN n'a pas besoin d'être coupé.

Produire des copies identiques du segment d'ADN cible : Dans un processus appelé extension, l'enzyme polymérase TAQ thermosensible est ajoutée à la réaction. La réaction est ensuite chauffée à 72 degrés Celsius, activant l'enzyme. L'enzyme ADN polymérase active se lie aux amorces et copie la séquence d'ADN entre elles. Le processus initial de séquençage et de clonage de l'ADN est terminé.

Augmenter le rendement en ADN cloné : Le processus initial d'annelage et d'extension crée relativement peu de copies des segments de brin d'ADN disponibles. Pour augmenter le rendement grâce à une réplication supplémentaire de l'ADN, la réaction est à nouveau refroidie pour réactiver les amorces et les laisser se lier à d'autres brins d'ADN.

Ensuite, le réchauffage de la réaction active à nouveau l'enzyme polymérase et d'autres copies sont produites. Ce cycle peut être répété 25 à 30 fois.

La méthode du vecteur plasmidique repose sur un approvisionnement initial suffisant d'ADN à couper et à insérer dans les plasmides. Trop peu d'ADN d'origine entraîne moins de plasmides et un démarrage lent de la production d'ADN cloné.

La méthode PCR peut produire une grande quantité d'ADN à partir de quelques brins d'ADN originaux, mais comme l'ADN n'est pas implanté dans une cellule bactérienne, la production de protéines n'est pas possible.

Pour produire la protéine codée dans les fragments d'ADN à cloner à partir d'un petit échantillon d'ADN initial, les deux méthodes peuvent être utilisées ensemble, et elles peuvent se complètent. Tout d'abord, la méthode PCR est utilisée pour cloner l'ADN à partir d'un petit échantillon et produire de nombreuses copies.

Ensuite, les produits de PCR sont utilisés avec la méthode du vecteur plasmidique pour implanter l'ADN produit dans des cellules bactériennes qui produiront la protéine souhaitée.

La biologie moléculaire utilise le clonage de gènes et la réplication d'ADN à des fins médicales et commerciales. Les bactéries avec des séquences d'ADN clonées sont utilisées pour produire des médicaments et remplacer des substances que les personnes atteintes de troubles génétiques ne peuvent pas produire elles-mêmes.

Les utilisations typiques incluent :

• Le gène de insuline humaine est cloné dans des bactéries qui produisent ensuite l'insuline utilisée par les diabétiques.
• L'activateur tissulaire du plasminogène est produit à partir d'ADN cloné et utilisé pour aider prévenir les caillots sanguins.
• Hormone de croissance humaine peut être produit et administré à des personnes qui ne peuvent pas le produire elles-mêmes.

La biotechnologie utilise également le clonage de gènes en agriculture pour créer de nouvelles caractéristiques chez les plantes et les animaux ou pour améliorer les caractéristiques existantes. Au fur et à mesure que de plus en plus de gènes sont clonés, le nombre d'utilisations possibles augmente de façon exponentielle.

Les molécules d'ADN constituent une petite fraction du matériel d'une cellule vivante, et il est difficile d'isoler les influences des nombreux gènes. Les méthodes de clonage d'ADN fournissent de grandes quantités d'une séquence d'ADN spécifique pour l'étude, et l'ADN produit des protéines tout comme il le faisait dans la cellule d'origine. Le clonage d'ADN permet d'étudier ce fonctionnement pour différents gènes isolément.

Les applications typiques de la recherche et de la technologie de l'ADN comprennent l'examen :

• Fonction d'un gène.
• Mutations d'un gène.
• L'expression du gène.
• Produits génétiques.
• Défauts génétiques.

Lorsque plus de séquences d'ADN sont clonées, il est plus facile de trouver et de cloner des séquences supplémentaires. Les segments d'ADN clonés existants peuvent être utilisés pour déterminer si un nouveau segment correspond à l'ancien et quelles parties sont différentes. L'identification d'une séquence d'ADN cible est alors plus rapide et plus précise.

Dans thérapie génique, un gène cloné est présenté aux cellules d'un organisme dont le gène naturel est endommagé. Un gène vital qui produit une protéine requise pour une fonction spécifique d'un organisme pourrait être muté, modifié par des radiations ou affecté par des virus.

Lorsque le gène ne fonctionne pas correctement, une substance importante manque à la cellule. La thérapie génique tente de remplacer le gène par une version clonée qui produira la substance requise.

La thérapie génique est encore expérimentale et peu de patients ont été guéris grâce à cette technique. Les problèmes résident dans l'identification du gène unique responsable d'une condition médicale et dans la délivrance de nombreuses copies du gène aux bonnes cellules. Comme le clonage d'ADN s'est répandu, la thérapie génique a été appliquée dans plusieurs situations spécifiques.

Les récentes applications retenues comprennent :

• La maladie de Parkinson: En utilisant un virus comme vecteur, un gène lié à la maladie de Parkinson a été injecté dans le mésencéphale des patients. Les patients ont connu une amélioration de leurs capacités motrices sans aucun effet secondaire indésirable.
• Déficit en adénosine désaminase (ADA) : Un trouble immunitaire génétique a été traité en retirant les cellules souches sanguines des patients et en insérant le gène ADA. Les patients ont ainsi pu produire au moins une partie de leur propre ADA.
• Hémophilie: Les personnes atteintes d'hémophilie ne produisent pas de protéines spécifiques qui favorisent la coagulation du sang. Un gène pour la production de l'une des protéines manquantes a été inséré dans les cellules hépatiques des patients. Les patients ont produit la protéine et les incidents hémorragiques ont été réduits.

La thérapie génique est l'une des applications les plus prometteuses du clonage d'ADN, mais d'autres nouvelles utilisations sont susceptibles de proliférer à mesure que davantage de séquences d'ADN sont étudiées et que leur fonction est déterminée. Le clonage d'ADN fournit la matière première pour le génie génétique dans les quantités nécessaires.

Lorsque le rôle des gènes est connu et que leur bon fonctionnement peut être assuré par le remplacement des gènes défectueux gènes, de nombreuses maladies chroniques et même le cancer peuvent être attaqués et traités au niveau génétique en utilisant l'ADN La technologie.

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