Dans l'électrophorèse sur gel, les échantillons d'ADN ou de protéines sont séparés - généralement en fonction de la taille - en appliquant un champ électrique qui les fait migrer à travers un gel. L'utilisation de l'électrophorèse sur gel est courante dans les laboratoires de recherche biomédicale et est utilisée pour répondre à une variété de questions différentes, il n'y a donc pas vraiment de moyen universel d'analyser les résultats.
Différentes techniques telles que le transfert Western, le transfert Northern et le transfert Southern, par exemple, impliquent toutes électrophorèse sur gel.
Si tu fais Gel d'agarose électrophorèse d'échantillons d'ADN, le type de procédure le plus courant, vous devrez généralement faire au moins deux choses: 1) distinguer les non-coupés plasmides à partir d'inserts, de plasmides entaillés et de plasmides coupés et, 2) estimer la taille des différents fragments d'ADN avec une courbe étalon Excel ou calculatrice.
Vérifiez votre cahier de laboratoire pour déterminer quels échantillons ont été chargés dans quelles voies. Lorsque vous avez chargé les puits pour votre gel, vous devez avoir noté l'identité de chaque piste/échantillon.
À l'aide d'une règle, mesurez la distance sur votre photo entre les puits et le colorant de suivi, ce qui ont voyagé plus loin qu'aucune des bandes d'ADN (en d'autres termes, il sera au bas de la gel). Notez ce nombre -- les unités que vous utilisez ne sont pas importantes.
Mesurez la distance sur votre photo entre les puits et chacune des bandes de "l'échelle", puis divisez cette distance par la distance parcourue par le colorant de suivi bande. Ce calcul vous donne la mobilité relative de chaque bande.
Exemple: supposons que la bande de colorant de suivi a parcouru 6 pouces et que nous ayons trois bandes qui ont parcouru 5, 4,5 et 3,5 pouces.
Quelle est leur mobilité relative? Réponse: On divise 5, 4,5 et 3,5 par 6 pour obtenir des mobilités relatives de 0,833, 0,75 et 0,5833.
Le fabricant vous donne la taille de chaque fragment dans les échelles qu'il fournit, vous devriez donc déjà avoir cette information.
Utilisez la fonction Trendline sur votre tableur pour ajuster une équation aux données. Cette équation doit être une équation de puissance (par exemple x^-2) et doit s'adapter relativement bien aux données (coefficient R d'au moins 0,9). Cela crée une courbe et une courbe standard Exceller.
N'oubliez pas que les fragments d'ADN plus petits traversent le gel plus loin que les gros fragments d'ADN, de sorte que les plus proches du colorant de suivi seront les plus petits. Notez cependant que si plasmide L'ADN (circulaire) n'est pas coupé, il deviendra "super enroulé" ou tordu comme un cordon téléphonique, ce qui le fera voyager plus loin qu'un ADN linéaire de même taille.
De même, un plasmide « coupé » qui a été incomplètement coupé parcourra un plus court distance qu'un ADN linéaire de même taille. Par conséquent, vous ne pouvez pas estimer la taille des plasmides non coupés à partir de votre gel.
Faites correspondre les bandes de chaque voie avec l'identité de l'échantillon que vous avez chargé dans cette voie et déterminez si ce que vous voyez correspond à ce à quoi vous vous attendiez. Cela dépendra de la nature de votre expérience.
En général, cependant, si vous digérez un plasmide d'insertion avec deux enzymes de restriction, vous vous attendez à ce que l'insertion soit libérée du plasmide.
Comme il est beaucoup plus petit que le plasmide, vous vous attendriez à voir deux bandes dans cette voie, l'une près du haut et l'autre vers le bas près du bas. Un plasmide coupé avec une seule enzyme de restriction ne doit former qu'une seule bande qui voyage un peu plus loin que le plasmide coupé avec deux les enzymes de restriction, mais loin d'être aussi loin que l'insert.
Mesurez la distance entre les puits et le plasmide coupé et insérez les bandes avec votre règle. Divisez ces nombres par la distance parcourue par le colorant de suivi pour trouver la mobilité relative des inserts et des plasmides coupés.
