En biologie moléculaire, un bon choix de tampon et une bonne préparation pour différentes étapes d'isolement de l'ADN peuvent être la différence entre passer à l'expression des protéines ou ouvrir un autre kit de maxi-prep pour commencer plus de. Malgré leur importance cruciale, les recettes tampons ne sont souvent que cela: des recettes écrites sans explication ni justification pour les différents composants. Un tel tampon est le tampon glucose-tris-EDTA ou GTE.
A quoi sert GTE ?
GTE est utilisé pour remettre en suspension les culots de cellules bactériennes avant de lyser (ouvrir) les cellules et de récolter l'ADN plasmidique à l'intérieur. Le lysozyme, qui ramollit les membranes cellulaires, est souvent ajouté avec le tampon GTE. L'obtention d'une suspension homogène de cellules entières au cours de cette étape afin que la solution de lyse ajoutée par la suite puisse atteindre toutes les cellules est la clé pour obtenir de bons rendements en ADN. GTE est conçu pour cela tout en fournissant un environnement stable pour l'ADN.
Glucose pour l'osmolarité
Du sucre de glucose 50 mM (millimolaire) est ajouté au tampon GTE pour maintenir l'osmolarité là où la concentration de soluté à l'extérieur des cellules est proche de celle à l'intérieur des cellules. Cela empêche la lyse cellulaire prématurée, qui peut entraîner une baisse des rendements en ADN en raison de l'agrégation et de la dégradation. Les autres composants du tampon contribuent également à l'osmolarité de la solution, mais le glucose, étant un non-électrolyte, est un bon choix car il n'interfère pas avec le tampon de la solution Propriétés.
Tris pour la stabilité du pH
Tris est le nom abrégé du tris (hydroxyméthyl) aminométhane, qui est un tampon de pH très courant. Dans le cas du tampon GTE, le sel d'acide (Tris-HCl) est ajouté au tampon à une concentration de 25mM. Cela maintient le pH de la solution à un niveau quasi physiologique de 8,0, un pH idéal pour empêcher l'hydrolyse acide (dégradation) de l'ADN plasmidique et les réactions secondaires indésirables des autres composants cellulaires.
L'EDTA empêche la dégradation de l'ADN
L'EDTA, ou acide éthylènediaminetétraacétique, capture ou « chélate » les ions métalliques hors de la solution, les empêchant de participer à des réactions secondaires indésirables. Dans le tampon GTE, l'EDTA est ajouté à 10 mM. Son objectif principal est dans le tampon d'arrondir le zinc, le magnésium et le calcium libres, empêchant ainsi la dégradation de l'ADN par certaines voies qui nécessitent ces métaux.
Quelques conseils importants
Gardez votre tampon GTE au froid et préparez-le en petites quantités pour empêcher la croissance de bactéries involontaires. Le sucre et le pH contrôlé en font un excellent milieu de croissance. Utilisez toujours de l'eau purifiée. L'eau du robinet peut contenir un excès d'ions métalliques provenant des tuyaux, ce qui peut dépasser la capacité de capture de l'EDTA. Si vous suspectez la présence d'ARN interférent dans votre échantillon, ajoutez de la RNase A à 100 microgrammes par millilitre à votre tampon GTE pour éliminer le problème.