Séquençage de l'ADN: définition, méthodes, exemples

Les nucléotides sont les éléments constitutifs chimiques de la vie et se trouvent dans l'ADN des organismes vivants. Chaque nucléotide est constitué de un sucre, phosphate et un base azotée: adénine (A), thymine (T), cytosine (C) et guanine (G). L'ordre spécifique de ces bases nucléotidiques détermine quelles protéines, enzymes et molécules seront synthétisées par la cellule.

Déterminer l'ordre, ou la séquence des nucléotides, est important pour l'étude de mutation, évolution, progression de la maladie, tests génétiques, investigation médico-légale et médecine.

Génomique est l'étude de l'ADN, des gènes, des interactions géniques et des influences environnementales sur les gènes. Le secret pour démêler le fonctionnement interne complexe des gènes est de pouvoir identifier leur structure et leur emplacement sur les chromosomes.

Le modèle des organismes vivants est déterminé par l'ordre (ou la séquence) des paires de bases d'acides nucléiques dans l'ADN. Lorsque l'ADN se réplique, l'adénine s'apparie avec la thymine et la cytosine avec la guanine; les paires non concordantes sont considérées

Depuis la double hélice acide désoxyribonucléique (ADN) a été conceptualisée en 1953, des améliorations spectaculaires ont été apportées dans le domaine de la génomique et du séquençage de l'ADN à grande échelle. Les scientifiques travaillent avec diligence pour appliquer ces nouvelles connaissances au traitement individualisé des maladies.

Dans le même temps, les discussions en cours permettent aux chercheurs de garder une longueur d'avance sur les implications éthiques de ces technologies qui explosent rapidement.

Le séquençage de l'ADN est le processus de découverte de la séquence de diverses bases nucléotidiques dans des extraits d'ADN. Le séquençage de gènes entiers permet des comparaisons de chromosomes et de génomes présents dans la même espèce et dans des espèces différentes.

La cartographie des chromosomes est utile pour la recherche scientifique. Analyser les mécanismes et la structure de gènes, les allèles et les mutations chromosomiques dans les molécules d'ADN suggèrent de nouvelles façons de traiter les troubles génétiques et d'arrêter la croissance des tumeurs cancéreuses, par exemple.

Les méthodes de séquençage de l'ADN de Frederick Sanger considérablement fait avancer le domaine de la génomique à partir des années 1970. Sanger s'est senti prêt à s'attaquer au séquençage de l'ADN après avoir réussi le séquençage de l'ARN lors de l'étude de l'insuline. Sanger n'a pas été le premier scientifique à se lancer dans le séquençage de l'ADN. Cependant, ses méthodes intelligentes de séquençage de l'ADN - développées en tandem avec ses collègues Berg et Gilbert - ont remporté un prix Nobel en 1980.

Sanger connaissait la valeur potentielle de son travail et collaborait souvent avec d'autres scientifiques qui partageaient ses intérêts pour l'ADN, biologie moléculaire et sciences de la vie.

Bien que lentes et coûteuses par rapport aux technologies de séquençage d'aujourd'hui, les méthodes de séquençage de l'ADN de Sanger ont été saluées à l'époque. Après essais et erreurs, Sanger a trouvé la « recette » biochimique secrète pour séparer les brins d'ADN, créer plus d'ADN et identifier l'ordre des nucléotides dans un génome.

Des matériaux de haute qualité peuvent être facilement achetés pour une utilisation dans des études de laboratoire :

• ADN polymérase est l'enzyme nécessaire à la fabrication de l'ADN.
• amorce d'ADN indique à l'enzyme où commencer à travailler sur le brin d'ADN.
• dNTP sont des molécules organiques constituées de sucre désoxyribose et de nucléosides triphosphates – dATP, dGTP, dCTP et dTTP – qui assemblent les protéines
• Terminateurs de chaîne sont des nucléotides colorés, également appelés nucléotides terminateurs pour chaque base - A, T, C et G.

Sanger a découvert comment couper l'ADN en petits segments en utilisant l'enzyme ADN polymérase.

Il a ensuite fabriqué plus d'ADN à partir d'une matrice et inséré des traceurs radioactifs dans le nouvel ADN pour délimiter des sections des brins séparés. Il a également reconnu que l'enzyme avait besoin d'une amorce qui pourrait se lier à un endroit spécifique sur le brin matrice. En 1981, Sanger est de nouveau entré dans l'histoire en découvrant le génome des 16 000 paires de bases de l'ADN mitochondrial.

La température doit être soigneusement ajustée tout au long du processus de séquençage. Tout d'abord, des produits chimiques sont ajoutés à un tube et chauffés pour démêler (dénaturer) le double brin Molécule d'ADN. Ensuite, la température est refroidie, permettant à l'apprêt de se lier.

Ensuite, la température est augmentée pour favoriser une activité optimale de l'ADN polymérase (enzyme).

La polymérase utilise généralement les nucléotides normaux disponibles, qui sont ajoutés à une concentration plus élevée. Lorsque la polymérase atteint un nucléotide lié à un colorant «terminant la chaîne», la polymérase s'arrête et le la chaîne se termine là, ce qui explique pourquoi les nucléotides teints sont appelés «terminaison de chaîne» ou « terminateurs ».

Le processus continue de très nombreuses fois. Finalement, le nucléotide lié au colorant a été placé à chaque position de la séquence d'ADN. L'électrophorèse sur gel et les programmes informatiques peuvent ensuite identifier les couleurs de colorant sur chacun des brins d'ADN et comprendre la séquence complète de l'ADN en fonction du colorant, de la position du colorant et de la longueur du brins.

Séquençage à haut débit – généralement appelé séquençage de nouvelle génération – utilise les nouvelles avancées et technologies pour séquencer les bases nucléotidiques plus rapidement et à moindre coût que jamais auparavant. Une machine de séquençage d'ADN peut facilement gérer des étendues d'ADN à grande échelle. En fait, les génomes entiers peuvent être réalisés en quelques heures, au lieu d'années avec les techniques de séquençage de Sanger.

Les méthodes de séquençage de nouvelle génération peuvent gérer l'analyse d'ADN à haut volume sans l'étape supplémentaire d'amplification ou de clonage pour obtenir suffisamment d'ADN pour le séquençage. Les machines de séquençage d'ADN exécutent plusieurs réactions de séquençage en même temps, ce qui est moins cher et plus rapide.

Essentiellement, la nouvelle technologie de séquençage de l'ADN exécute des centaines de réactions de Sanger sur une petite puce facilement lisible qui est ensuite exécutée via un programme informatique qui assemble la séquence.

La technique lit des fragments d'ADN plus courts, mais elle est toujours plus rapide et plus efficace que les méthodes de séquençage de Sanger, de sorte que même les projets à grande échelle peuvent être achevés rapidement.

le Projet du génome humain, achevée en 2003, est l'une des études de séquençage les plus célèbres réalisées à ce jour. Selon un article de 2018 dans Actualités scientifiques, le génome humain est constitué d'environ 46 831 gènes, ce qui était un formidable défi à séquencer. Les meilleurs scientifiques du monde entier ont passé près de 10 ans à collaborer et à consulter. Dirigé par le National Human Genome Research

Institute, le projet a réussi à cartographier le génome humain à l'aide d'un échantillon composite prélevé sur des donneurs de sang anonymes.

Le projet du génome humain s'est appuyé sur des méthodes de séquençage de chromosomes artificiels bactériens (basés sur le BAC) pour cartographier les paires de bases. La technique utilisait des bactéries pour cloner des fragments d'ADN, résultant en de grandes quantités d'ADN pour le séquençage. Les clones ont ensuite été réduits en taille, placés dans une machine de séquençage et assemblés en tronçons représentant l'ADN humain.

Les nouvelles découvertes en génomique modifient profondément les approches de la prévention, de la détection et du traitement des maladies. Le gouvernement a engagé des milliards de dollars dans la recherche sur l'ADN. Les forces de l'ordre s'appuient sur l'analyse ADN pour résoudre les cas. Des kits de test ADN peuvent être achetés pour un usage domestique afin de rechercher l'ascendance et d'identifier les variantes génétiques pouvant présenter des risques pour la santé :

• Analyse génomique implique de comparer et de contraster les séquences du génome de nombreuses espèces différentes dans les domaines et les règnes de la vie. Le séquençage de l'ADN peut révéler des modèles génétiques qui jettent un nouvel éclairage sur le moment où certaines séquences ont été introduites au cours de l'évolution. L'ascendance et la migration peuvent être retracées via une analyse ADN et comparées aux enregistrements historiques.

• Les progrès de la médecine se produisent à un rythme exponentiel car pratiquement toutes les maladies humaines ont une composante génétique. Le séquençage de l'ADN aide les scientifiques et les médecins à comprendre comment plusieurs gènes interagissent les uns avec les autres et avec l'environnement. Le séquençage rapide de l'ADN d'un nouveau microbe à l'origine d'une épidémie peut aider à identifier des médicaments et des vaccins efficaces avant que le problème ne devienne un grave problème de santé publique. Les variants génétiques dans les cellules cancéreuses et les tumeurs pourraient être séquencés et utilisés pour développer des thérapies géniques individualisées.

• Sciences médico-légales Les applications ont été utilisées pour aider les forces de l'ordre à résoudre des milliers de cas difficiles depuis la fin des années 1980, selon le Institut national de la justice. Les preuves sur les lieux du crime peuvent contenir des échantillons d'ADN provenant d'os, de cheveux ou de tissus corporels qui peuvent être comparés au profil ADN d'un suspect pour aider à déterminer la culpabilité ou l'innocence. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une méthode couramment utilisée pour faire des copies d'ADN à partir de traces avant le séquençage.

• Séquençage des espèces nouvellement découvertes peut aider à identifier quelles autres espèces sont les plus étroitement liées et révéler des informations sur l'évolution. Les taxonomistes utilisent des « codes-barres » ADN pour classer les organismes. Selon le Université de Géorgie en mai 2018, il y a environ 303 espèces de mammifères encore à découvrir.

• Tests génétiques pour les maladies rechercher des variantes de gènes mutés. La plupart sont des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), ce qui signifie qu'un seul nucléotide de la séquence est modifié par rapport à la version « normale ». Les facteurs environnementaux et le mode de vie affectent comment et si certains gènes sont exprimés. Des entreprises mondiales mettent des technologies de séquençage de nouvelle génération de pointe à la disposition des chercheurs du monde entier intéressés par les interactions multigéniques et le séquençage du génome entier.

• Kits ADN de généalogie utiliser des séquences d'ADN dans leur base de données pour rechercher des variantes dans les gènes d'un individu. Le kit nécessite un échantillon de salive ou un écouvillon de joue qui est envoyé à un laboratoire commercial pour analyse. En plus des informations sur l'ascendance, certains kits peuvent identifier des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) ou d'autres variantes génétiques bien connues telles que les gènes BRCA1 et BRCA2 associés à un risque élevé pour le sein féminin et cancer des ovaires.

Les nouvelles technologies s'accompagnent souvent de la possibilité d'avantages sociaux, ainsi que de préjudices; les exemples incluent les centrales nucléaires défectueuses et les armes nucléaires de destruction massive. Les technologies de l'ADN comportent également des risques.

Les préoccupations émotionnelles concernant le séquençage de l'ADN et les outils d'édition de gènes comme CRISPR incluent les craintes que le la technologie pourrait faciliter le clonage humain, ou conduire à des animaux transgéniques mutants créés par un voyou scientifique.

Le plus souvent, les problèmes éthiques liés au séquençage de l'ADN sont liés au consentement éclairé. Un accès facile aux tests ADN directement destinés aux consommateurs signifie que les consommateurs peuvent ne pas comprendre pleinement comment leurs informations génétiques seront utilisées, stockées et partagées. Les profanes peuvent ne pas être émotionnellement prêts à en apprendre davantage sur leurs variantes génétiques défectueuses et leurs risques pour la santé.

Des tiers tels que les employeurs et les compagnies d'assurance pourraient potentiellement discriminer les individus porteurs de gènes défectueux pouvant entraîner de graves problèmes médicaux.