Kemistit käyttävät korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa tai HPLC: tä erottamaan yhdisteiden seokset. Yleensä menetelmä koostuu näytteen injektoimisesta pylvääseen, jossa se sekoittuu yhden tai useamman liuottimen kanssa. Eri yhdisteet adsorboituvat tai "tarttuvat" pylvääseen eri asteissa; ja kun liuotin työntää yhdisteet kolonnin läpi, yksi seoksen komponenteista poistuu ensin kolonnista. Instrumentti havaitsee yhdisteet poistuessaan pylväästä ja tuottaa kromatogrammin, joka koostuu käyrästä, jossa retentioaika on x-akselilla ja signaalin voimakkuus detektorista y-akselilla. Kun yhdisteet poistuvat pylväästä, ne tuottavat "piikkejä" kromatogrammissa. Yleensä mitä kauempana toisistaan ja kapeammat piikit kromatogrammissa, sitä suurempi resoluutio on. Tutkijoiden mielestä resoluutio 1,0 tai suurempi edustaa riittävää erottelua.
Mittaa kahden vierekkäisen piikin leveydet kromatogrammissa ottamalla huomioon, missä x-akselin arvot ovat kunkin piikin pohjassa. X-akseli edustaa retentioaikaa, yleensä mitattuna sekunteina. Jos huippu alkaa 15,1 sekunnissa ja päättyy 18,5 sekunnissa, sen leveys on (18,5 - 15,1) = 3,4 sekuntia.
Määritä retentioajat merkitsemällä aika eli x-akselin sijainti, joka vastaa piikkien maksimien sijainteja. Tämä arvo on tavallisesti noin puolivälissä niiden kahden arvon välillä, joita käytetään vaiheessa 1 leveyden laskemiseen. Esimerkiksi vaiheessa 1 annetun esimerkin maksimiarvo olisi noin 16,8 sekuntia.
Laske erotuskyky R kahden piikin välillä seuraavasti:
R = \ frac {RT_1-RT_2} {0,5 (W_1 + W_2)}
missä RT1 ja RT2 edustavat piikkien 1 ja 2 retentioaikoja ja W1 ja W2 edustavat niiden pohjassa otettujen piikkien leveyksiä. Jatkamalla esimerkkiä vaiheista 2 ja 3, yhden huipun retentioaika on 16,8 sekuntia ja leveys 3,4 sekuntia. Jos toisen piikin retentioaika oli 21,4 sekuntia ja leveys 3,6 sekuntia, resoluutio olisi:
R = \ frac {21,4-16,8} {0,5 (3,4 + 3,6)} = 1,3
Tarvittavat asiat
- HPLC-kromatogrammi
- Laskin
