Mitä pakkasmurtuma on ja miksi siitä on hyötyä solubiologiassa?

Solukalvot koostuvat fosfolipideistä ja kiinnittyneistä tai upotetuista proteiineista. Kalvoproteiineilla on tärkeä rooli solujen aineenvaihdunnassa ja elämässä. Et voi käyttää tavallista mikroskopiaa tarttuvien proteiinien, kuljetusproteiinien ja proteiinikanavien visualisointiin tai karakterisoimiseksi solukalvossa. Käyttämällä elektronimikroskopiaa ja tekniikkaa, jota kutsutaan "jäädytysmurtumaksi", joka jakaa jäädytetyt solukalvot toisistaan, mahdollistaa kalvorakenteen visualisoinnin ja proteiinien organisoitumisen fosfolipidit. Muiden menetelmien yhdistäminen pakkasmurtumiseen auttaa meitä ymmärtämään paitsi solukalvojen rakenteen ja kalvoproteiineja, mutta mahdollistaa visualisoinnin ja yksityiskohtaisen analyysin tiettyjen proteiinien, bakteerien ja viruksia.

Nestemäistä typpeä käyttämällä biologiset kudosnäytteet tai solut pakastetaan nopeasti solujen ainesosien immobilisoimiseksi. Solukalvot koostuvat kahdesta kerroksesta fosfolipidejä, joita kutsutaan kaksikerroksisiksi, jolloin hydrofobiset tai vettä vihaavat lipidihännät osoittavat kalvon sisäpuoli ja lipidimolekyylin hydrofiiliset tai vettä rakastavat päät osoittavat ulospäin ja kohti solu. Jäädytetty näyte murtuu tai murtuu mikrotomilla, joka on veitsen muotoinen instrumentti ohuiden kudosviipaleiden leikkaamiseen. Tämä saa solukalvon hajoamaan tarkalleen kahden kerroksen väliin, koska vetovoima hydrofobisten lipidipäästen välillä edustaa heikointa kohtaa. Murtamisen jälkeen näytteelle tehdään tyhjiömenetelmä, jota kutsutaan "pakkasetsaukseksi". Murtuneen pinta näyte varjostetaan hiili- ja platinahöyryllä, jotta saadaan vakaa kopio, joka seuraa murtuman ääriviivoja kone. Happoa käytetään kopioon kiinnittyvän orgaanisen materiaalin pilkkomiseen, jolloin murtuneesta kalvopinnasta jää ohut platinakuori. Tämä kuori analysoidaan sitten elektronimikroskopialla.

Pakkasetsaus on kiinnittämättömän, jäädytetyn ja pakkasmurtuneen biologisen näytteen tyhjiökuivaus. Tyhjiökuivausmenettely on samanlainen kuin pakastekuivatut hedelmät ja vihannekset, jotka pakataan ja myydään ruokakaupoissa. Ilman pakkasetsausta jääkiteet peittävät monia solurakenteen yksityiskohtia. Syvä- tai pakkasetsausvaihe parantaa ja laajentaa alkuperäistä pakastusmurtumamenetelmää, mikä mahdollistaa solukalvojen havainnoinnin eri toimintojen aikana. Se mahdollistaa kalvorakenteen lisäksi myös solunsisäisten komponenttien analysoinnin ja tarjoaa yksityiskohtaisia ​​rakenteellisia tietoja bakteereista, viruksista ja suurista soluproteiineista komplekseja.

Elektronimikroskopia voi paljastaa ja suurentaa yli miljoona kertaa pienimmätkin organismit tai rakenteet, kuten bakteerit, virukset, solunsisäiset komponentit ja jopa proteiinit. Visualisointi syntyy pommittamalla erittäin ohutta näytettä elektronisuihkulla. Kaksi elektronimikroskopiamenetelmää ovat pyyhkäisyelektronimikroskopia eli SEM ja lähetyselektronimikroskopia tai TEM. Pakastemurtumanäytteet analysoidaan rutiininomaisesti TEM: llä. TEM: llä on parempi resoluutio kuin SEM: llä, ja se tarjoaa rakenteellista tietoa jopa 3 nanometrin kopioihin.

Pakastemurtumalektronimikroskopian kehittäminen ja käyttö osoittivat, että soluplasman membraanit koostuvat lipidikaksoiskerroksista ja selvittivät, kuinka proteiinit ovat organisoituneet solukalvoissa. Pakastemurtuma antaa ainutlaatuisen ilmeen solukalvojen sisäpuolelle, koska se jakaa ja erottaa kalvofosfolipidit kahteen vastakkaiseen ja toisiaan täydentävään levyyn tai pintaan. Ensimmäisen pakastusmurtumakoneen käyttöönoton jälkeen kuluneista yli 50 vuoden aikana platinakopion tekeminen on edelleen ainoa tapa saada rakenteellisia tietoja solukalvosta. Tekniikka osoittaa, kelluvatko spesifiset proteiinit vai ankkuroituvatko ne solukalvoon, ja aggregoituvatko ja miten jotkut proteiinit. Uudempi menetelmä - käyttäen spesifisiin proteiineihin kohdistuvia vasta-aineita - yhdistetään jäädytysmurtumaan proteiinien ja niiden toiminnan tunnistamiseksi solukalvossa.