DNA
Deoksiribonukleiinihappo ja proteiinit. DNA on järjestetty yksiköiksi, joita kutsutaan geeneiksi, joista kukin koodaa tiettyä RNA- tai proteiinisekvenssiä. Geenien tutkitaan oppivan biologisesta rakenteesta ja toiminnasta, evoluutiosta, taudeista ja monista muista elävien järjestelmien näkökohdista. Geenien yksityiskohtaiseen tutkimiseen DNA on eristettävä ja puhdistettava kiinnostavista soluista.
DNA-uutto
Vaikka yksittäisen solun DNA voidaan erottaa ja tutkia, se ei riitä nähdä paljaalla silmällä. Saadaksesi riittävän määrän taustatulostusta, sitä enemmän soluja sinun on työskenneltävä, sitä parempi (useita miljoonia).
Tarkat protokollat vaihtelevat huomattavasti tiettyjen näytteiden ainutlaatuisten ominaisuuksien huomioon ottamiseksi, mutta yleisiä vaiheita ovat homogenointi, hajoaminen, pilkkominen, erottaminen ja kerääminen. Menettely on parasta suorittaa pienessä (näytteen koosta riippuen) lasi- tai muoviputkessa.
Näyte yleensä sekoitetaan tai jauhetaan solujen erottamiseksi perusteellisesti toisistaan. Tämä tekee solujen ainesosista helpommin saatavilla olevien reagenssien saataville. Pesuaine tai entsyymit lisätään sitten homogenaattiin solukalvojen (ja ydinkalvojen, jos solut ovat eukaryoottisia), hajottamiseksi DNA: n vapauttamiseksi. Tässä vaiheessa DNA: ta ympäröivät proteiinit, lipidit, hiilihydraatit ja kaikki muu soluissa oleva.
Lisäentsymaattinen pilkkominen voi olla tarpeen proteiinien hajottamiseksi, jotta ne eivät sitoutuisi DNA: han ja häiritsevät sen keräämistä. DNA erotetaan solun muusta sisällöstä lisäämällä kylmää, puhdasta, etyyli- tai isopropyylialkoholia. DNA ei liukene näihin alkoholeihin, joten se tiivistyy yrittäen minimoida kosketuksensa alkoholiin. Kondensoitunut DNA kerättiin sitten, yleensä sentrifugoimalla tai kelaamalla.
DNA-kelaus
DNA: n kerääminen kelaamalla on tehokasta, kun uuttomenettelystä saadaan suuri määrä DNA: ta. Se on myös erinomainen esittelymenetelmä, koska vaikuttava puhtaan DNA: n sotku on selvästi näkyvissä.
DNA: n kelaamiseksi erotusvaihe on suoritettava huolellisesti. Jos se ei ollut osa aiemmin lisättyä hajotusreagenssiseosta, väkevöity suolaliuos (natriumkloridi) on lisättävä liuokseen ennen alkoholin lisäysvaihetta. Kylmä alkoholi kaadetaan hitaasti koeputken sivua pitkin muodostamaan kerroksen vesiliuoksen päälle välttäen sekoittumista. Jos se tehdään oikein, alkoholi muodostaa oman kerroksen suolaisen kerroksen päälle. Sitten tulee kelaus.
DNA kerätään suolaisesta kerroksesta asettamalla varovasti lasisekoitustanko alkoholikerroksen läpi, kunnes se koskettaa putken pohjaa. Pyöritä sauvaa hitaasti sormien välissä samalla kun tarkkailet kahden kerroksen välistä rajapintaa. Jos läsnä on tarpeeksi DNA: ta, se kasautuu yhteen kerrosten välisellä rajapinnalla muodostaen maitomaisen läpikuultavan massan. Pyöritä sauvaa käärimään DNA sen ympärille (eli kelausosa) ja vedä se ulos putkesta. DNA voidaan siirtää toiseen putkeen puhdasta alkoholia varastointia tai lisäanalyysiä varten.
