DNA-kloonaus: Määritelmä, prosessi, esimerkkejä

On mahdollista kloonata kokonaisia ​​organismeja, kuten lampaita Dolly, mutta DNA: n kloonaus on erilaista. Se käyttää molekyylibiologian tekniikoita identtiset kopiot DNA-sekvensseistä tai yksittäisistä geeneistä.

Geenitekniikan menetelmillä tunnistetaan ja eristetään DNA-geenikoodin segmentit. DNA-kloonaus kopioi sitten nukleiinihappo sekvenssit segmenteissä.

Tuloksena olevia identtisiä kopioita voidaan käyttää jatkotutkimuksiin tai biotekniikan sovelluksiin. Usein kopioitu geeni koodaa proteiinia, joka voi olla osa lääketieteellistä hoitoa. DNA-tekniikka mukaan lukien DNA-kloonaus tukee ymmärtämistä siitä, miten geenit toimivat ja miten ihmisen geneettinen koodi vaikuttaa kehon toimintaan.

DNA-kloonaus on molekyylibiologinen prosessi, jolla tehdään identtiset kopiot kromosomeissa sijaitsevista DNA-segmenteistä, jotka sisältävät edistyneiden organismien geneettisen koodin.

Prosessi tuottaa suuria määriä kohde-DNA-sekvenssit. DNA-kloonauksen tarkoituksena on tuottaa itse kohde-DNA-sekvenssejä tai tuottaa kohdesekvensseihin koodattuja proteiineja.

Kaksi DNA-kloonauksessa käytettyä menetelmää kutsutaan plasmidivektori ja polymeraasiketjureaktio (PCR). vuonna plasmidivektori menetelmällä DNA-juosteet leikataan käyttäen restriktioentsyymit DNA-fragmenttien tuottamiseksi ja saadut segmentit insertoidaan kloonausvektoreihin, joita kutsutaan plasmideiksi, jotta niitä voidaan monistaa edelleen. Plasmidit sijoitetaan bakteerisoluihin, jotka sitten tuottavat DNA-kopioita tai koodattuja proteiineja.

vuonna PCR-menetelmä, kopioitavien DNA-säikeiden segmentti on merkitty entsyymeillä, joita kutsutaan alukkeet. Polymeraasientsyymi tekee kopioita DNA-juosteen merkittävästä osasta. Tämä menetelmä ei käytä restriktioentsyymejä, ja se voi tuottaa kloonattua DNA: ta pienistä näytteistä. Joskus kahta DNA-tekniikan menetelmää käytetään yhdessä sisällyttämään kummankin parhaat ominaisuudet kokonaisreaktioon.

Menetelmän vektori viittaa plasmidiin, jota käytetään kloonattavan kohde-DNA-segmentin pitämiseen. Plasmidit ovat pieniä pyöreitä säikeitä ei-kromosomaalinen DNA löytyy monista organismeista, mukaan lukien bakteerit ja virukset.

Bakteeriplasmidit ovat vektori, jota käytetään lisäämään kohde-DNA-segmentti bakteerisoluihin päällekkäisyyttä varten.

Kohde-DNA: n valinta ja eristäminen: Ennen kuin DNA-kloonausprosessi voi alkaa, on tunnistettava DNA-sekvenssit, erityisesti DNA-segmenttien alku ja päät.

Tällaiset DNA-sekvenssit voidaan löytää käyttämällä olemassa olevaa kloonattua DNA: ta tunnettujen sekvenssien kanssa tai tutkimalla kohde-DNA-sekvenssin tuottamaa proteiinia. Kun sekvenssi on tiedossa, voidaan käyttää vastaavia restriktioentsyymejä.

Kohde-DNA: n leikkaaminen restriktioentsyymeillä: Rajoitusentsyymit valitaan etsimään DNA-koodia kohdesekvenssien alussa ja lopussa.

Kun restriktioentsyymit löytävät erityisen koodatun sekvenssin emäsparista, joita kutsutaan restriktiokohdiksi, ne kiinnittyvät DNA: han kyseisessä paikassa ja kiertyvät DNA-molekyylin ympärille katkaisemalla säie. Leikatut DNA-segmentit, jotka sisältävät kohdesekvenssin, ovat nyt saatavissa kopiointia varten.

Plasmidivektorin valinta ja kohde-DNA: n lisääminen: Sopiva plasmidi sisältää ihanteellisesti samat DNA: ta koodaavat sekvenssit kuin DNA-juoste, josta kohde-DNA leikattiin. Plasmidin pyöreä DNA-juoste leikataan samoilla restriktioentsyymeillä kuin mitä käytettiin kohde-DNA: n leikkaamiseen.

A DNA-ligaasientsyymi käytetään DNA-segmenttien kytkemisen edistämiseen, ja kohde-DNA-segmentin päät kytkeytyvät plasmidi-DNA: n leikattuihin päihin. Kohde-DNA muodostaa nyt osan pyöreästä plasmidi-DNA-juosteesta.

Plasmidin lisääminen bakteerisoluun: Kun plasmidi sisältää kloonattavan DNA-sekvenssin, varsinainen kloonaus voi tapahtua käyttämällä prosessia, jota kutsutaan bakteerien transformaatio. Plasmidit insertoidaan bakteerisoluun, kuten E. coli, ja solut, joilla on uudet DNA-segmentit, alkavat tuottaa kopioita ja vastaavia proteiineja.

Bakteerimuunnoksessa isäntäsoluja ja plasmideja inkuboidaan yhdessä kehon lämpötilassa noin 12 tuntia. Solut absorboivat osan plasmidista ja käsittelevät niitä omana plasmidi-DNA: na.

Kloonatun DNA: n ja proteiinien kerääminen: Suurimmalla osalla DNA-kloonaukseen käytettyjä plasmideja on antibioottiresistenssigeenit DNA: han. Kun bakteerisolut imevät uusia plasmideja, ne tulevat vastustuskykyisiksi antibiooteille.

Kun viljelmää hoidetaan antibiooteilla, selviävät vain ne solut, jotka ovat absorboineet uudet plasmidit. Tuloksena on puhdas bakteerisoluviljelmä kloonatulla DNA: lla. Tämä DNA voidaan sitten kerätä tai vastaava proteiini voidaan tuottaa.

PCR menetelmä on yksinkertaisempi ja kopioi olemassa olevan DNA: n paikalleen. Se ei vaadi leikkaamista restriktioentsyymeillä tai insertointia plasmidiDNA sekvenssit. Tämä tekee siitä erityisen sopivan DNA-näytteiden kloonaamiseen rajoitetulla määrällä DNA-juosteita. Vaikka menetelmä voi kloonata DNA: n, sitä ei voida käyttää vastaavan proteiinin tuottamiseen.

DNA-säikeiden käämitys: Kromosomien DNA on kiertynyt tiukasti kaksoiskierre-rakenteessa. DNA: n lämmittäminen 96 celsiusasteeseen prosessissa, jota kutsutaan denaturaatio saa DNA-molekyylin kelautumaan ja erottumaan kahteen säikeeseen. Tämä erotus vaaditaan, koska vain yksi DNA-juoste voidaan kloonata kerralla.

Alustojen valinta: Kuten plasmidivektori-DNA-kloonauksessa, kloonattavat DNA-sekvenssit on tunnistettava kiinnittäen erityistä huomiota DNA-segmenttien alkuun ja päihin. Alukkeet ovat entsyymejä, jotka kiinnittyvät spesifisiin DNA-koodisekvensseihin, ja ne on valittava kohde-DNA-segmenttien merkitsemiseksi. Oikeat alukkeet kiinnittyvät DNA-molekyylisekvensseihin merkitsemään kohdesegmenttien alku ja päät.

Reaktion hehkutus alukkeiden sitomiseksi: Reaktion jäähdyttämistä noin 55 asteeseen kutsutaan hehkutus. Kun reaktio jäähtyy, alukkeet aktivoidaan ja kiinnittyvät DNA-juosteeseen kohde-DNA-segmentin kummassakin päässä. Alukkeet toimivat vain markkereina, eikä DNA-juosetta tarvitse leikata.

DNA-kohde-segmentin identtisten kopioiden tuottaminen: Kutsutussa prosessissa laajennus, lämpöherkkä TAQ-polymeraasientsyymi lisätään reaktioon. Reaktio kuumennetaan sitten 72 asteeseen aktivoimalla entsyymi. Aktiivinen DNA-polymeraasientsyymi sitoutuu alukkeisiin ja kopioi niiden välisen DNA-sekvenssin. Alkuperäinen DNA-sekvensointi- ja kloonausprosessi on valmis.

Kloonatun DNA: n tuoton lisääminen: Alkuperäinen hehkutus- ja jatkamisprosessi luo suhteellisen vähän kopioita käytettävissä olevista DNA-juosteista. Saannon lisäämiseksi ylimääräisen DNA-replikaation avulla reaktio jäähdytetään uudelleen alukkeiden uudelleenaktivoimiseksi ja annetaan niiden sitoutua muihin DNA-juosteisiin.

Sitten reaktion uudelleenlämmitys aktivoi polymeraasientsyymin uudelleen ja tuotetaan lisää kopioita. Tämä sykli voidaan toistaa 25-30 kertaa.

Plasmidivektorimenetelmä perustuu runsaaseen DNA: n alkuperäiseen saantiin plasmidien leikkaamiseksi ja insertoimiseksi. Liian vähän alkuperäistä DNA: ta johtaa vähemmän plasmideihin ja hitaaseen kloonatun DNA-tuotannon alkuun.

PCR-menetelmä voi tuottaa suuren määrän DNA: ta muutamasta alkuperäisestä DNA-säikeestä, mutta koska DNA: ta ei istuteta bakteerisoluun, proteiinituotanto ei ole mahdollista.

Pienestä alkuperäisestä DNA-näytteestä kloonattavien DNA-fragmenttien koodaaman proteiinin tuottamiseksi näitä kahta menetelmää voidaan käyttää yhdessä, ja ne voidaan täydentävät toisiaan. Ensin käytetään PCR-menetelmää DNA: n kloonaamiseksi pienestä näytteestä ja monien kopioiden tuottamiseksi.

Sitten PCR-tuotteita käytetään plasmidivektorimenetelmällä tuotetun DNA: n istuttamiseksi bakteerisoluihin, jotka tuottavat haluttua proteiinia.

Molekyylibiologiassa käytetään geenikloonausta ja DNA-replikointia lääketieteellisiin ja kaupallisiin tarkoituksiin. Bakteereja, joilla on kloonatut DNA-sekvenssit, käytetään tuottamaan lääkkeitä ja korvaamaan aineita, joita geneettisistä häiriöistä kärsivät ihmiset eivät pysty tuottamaan itse.

Tyypillisiä käyttötarkoituksia ovat:

• Geeni ihmisinsuliini kloonataan bakteereihin, jotka tuottavat sitten diabeetikoiden käyttämää insuliinia.
• Kudosplasminogeeniaktivaattori valmistetaan kloonatusta DNA: sta ja sitä käytetään auttamaan estää verihyytymiä.
• Ihmisen kasvuhormoni voidaan tuottaa ja antaa ihmisille, jotka eivät pysty tuottamaan sitä itse.

Biotekniikka käyttää myös geenikloonausta maataloudessa uusien ominaisuuksien luomiseen kasveille ja eläimille tai nykyisten ominaisuuksien parantamiseksi. Kun lisää geenejä kloonataan, mahdollisten käyttötapojen määrä kasvaa eksponentiaalisesti.

DNA-molekyylit muodostavat pienen osan materiaalista elävässä solussa, ja monien geenien vaikutuksia on vaikea eristää. DNA-kloonausmenetelmät toimittavat suuria määriä spesifistä DNA-sekvenssiä tutkimusta varten, ja DNA tuottaa proteiineja aivan kuten alkuperäisessä solussa. DNA-kloonaus tekee mahdolliseksi tutkia tätä operaatiota erilaisten geenien suhteen.

Tyypillisiä tutkimus- ja DNA-teknologiasovelluksia ovat muun muassa seuraavien tutkiminen:

• Geenin toiminta.
• Geenin mutaatiot.
• Geeniekspressio.
• Geenituotteet.
• Geneettiset viat.

Kun kloonataan useampia DNA-sekvenssejä, on helpompaa löytää ja kloonata muita sekvenssejä. Olemassa olevia kloonattuja DNA-segmenttejä voidaan käyttää määrittämään, vastaako uusi segmentti vanhaa ja mitkä osat ovat erilaisia. Kohde-DNA-sekvenssin tunnistaminen on silloin nopeampaa ja tarkempaa.

Sisään geeniterapia, kloonattu geeni esitetään sellaisen organismin soluille, jonka luonnollinen geeni on vaurioitunut. Tärkeä geeni, joka tuottaa proteiinia, jota tarvitaan tietylle organismin toiminnalle, voi olla mutaatioita, muuttaa säteilyllä tai vaikuttaa viruksiin.

Kun geeni ei toimi kunnolla, solusta puuttuu tärkeä aine. Geeniterapia yrittää korvaa geeni kloonatulla versiolla, joka tuottaa tarvittavan aineen.

Geeniterapia on edelleen kokeellista, ja harva potilas on parantunut tekniikalla. Ongelmia on lääketieteellisestä tilasta vastaavan yksittäisen geenin tunnistamisessa ja geenin monien kopioiden toimittamisessa oikeisiin soluihin. DNA-kloonauksen yleistyessä geeniterapiaa on sovellettu useissa erityistilanteissa.

Viimeisimmät onnistuneet sovellukset ovat:

• Parkinsonin tauti: Käyttämällä virusta vektorina Parkinsonin tautiin liittyvä geeni injektoitiin potilaiden keskiaivoihin. Potilailla oli parantunut motorinen taito ilman haitallisia sivuvaikutuksia.
• Adenosiinideaminaasin (ADA) puute: Geneettinen immuunihäiriö hoidettiin poistamalla potilaiden verikantasolut ja lisäämällä ADA-geeni. Potilaat pystyivät tuottamaan ainakin osan omasta ADA: sta.
• Hemofilia: Hemofiliapotilaat eivät tuota spesifisiä proteiineja, jotka auttavat veren hyytymistä. Geeni yhden puuttuvan proteiinin tuottamiseksi insertoitiin potilaiden maksasoluihin. Potilaat tuottivat proteiinia ja verenvuototapahtumat vähenivät.

Geeniterapia on yksi lupaavimmista DNA-kloonauksen sovelluksista, mutta muut uudet käyttötavat todennäköisesti lisääntyvät, kun tutkitaan lisää DNA-sekvenssejä ja määritetään niiden toiminta. DNA-kloonaus toimittaa geenitekniikan raaka-aineen tarvittavina määrinä.

Kun geenien rooli tunnetaan ja niiden oikea toiminta voidaan varmistaa korvaamalla vialliset geenejä, monia kroonisia sairauksia ja jopa syöpää voidaan hyökätä ja hoitaa geneettisellä tasolla käyttämällä DNA: ta tekniikkaa.

Asiaan liittyvä sisältö:

• E.Colin (Escherichia Coli) siirtomaaominaisuudet
• RNA: Määritelmä, toiminto, rakenne