Molekyylikloonaus on yleinen biotekniikan menetelmä, jonka jokaisen opiskelijan ja tutkijan tulisi tuntea. Molekyylikloonaus käyttäen restriktioentsyyminä kutsuttua entsyymityyppiä ihmisen DNA: n leikkaamiseksi fragmenteiksi, jotka voidaan sitten insertoida bakteerisolun plasmidi-DNA: han. Rajoitusentsyymit leikkaavat kaksijuosteisen DNA: n kahtia. Rajoitusentsyymistä riippuen leikkaus voi johtaa joko tahmeaan tai tylpään päähän. Tahmeat päät ovat hyödyllisempiä molekyylikloonauksessa, koska ne varmistavat, että ihmisen DNA-fragmentti työnnetään plasmidiin oikeaan suuntaan. Ligaatioprosessi tai DNA-fragmenttien fuusiointi vaatii vähemmän DNA: ta, kun DNA: lla on tahmeat päät. Lopuksi useat tahmeat pään restriktioentsyymit voivat tuottaa saman tahmean pään, vaikka kukin entsyymi tunnistaa erilaisen restriktiosekvenssin. Tämä lisää todennäköisyyttä, että mielenkiinnon kohteena oleva DNA-alueesi voidaan leikata tahmealla pääentsyymillä.
Rajoitusentsyymit ja rajoitussivustot
Rajoitusentsyymit ovat entsyymejä, jotka leikkaavat tunnistamaan spesifiset sekvenssit kaksijuosteisessa DNA: ssa ja leikkaavat DNA: n kahtia siinä sekvenssissä. Tunnistettua sekvenssiä kutsutaan restriktiokohdaksi. Rajoitusentsyymejä kutsutaan endonukleaaseiksi, koska ne leikkaavat kaksijuosteista DNA: ta, jollainen DNA on normaalisti, paikoissa, jotka ovat DNA: n päiden välissä. Erilaisia restriktioentsyymejä on yli 90. Kukin tunnistaa erillisen restriktiokohdan. Rajoitusentsyymit pilkkovat vastaavat restriktiokohdat 5000 kertaa tehokkaammin kuin muut kohdat, joita ne eivät tunnista.
Oikea suunta
Rajoitusentsyymit kuuluvat kahteen yleiseen luokkaan. Ne joko leikkaavat DNA: n tahmeaksi tai tylpäksi. Tahmeassa päässä on lyhyt nukleotidialue, DNA: n rakennuspalikat, joka on parittamaton. Tätä parittamatonta aluetta kutsutaan ulkonemaksi. Ylityksen sanotaan olevan tahmea, koska se haluaa ja muodostuu pariksi toisen tahmean pään kanssa, jolla on täydentävä ylitysjärjestys. Tahmeat päät ovat kuin kauan kadonneet kaksoset, jotka yrittävät halata toisiaan tiukasti, kun he kohtaavat. Toisaalta tylpät päät eivät ole tahmeat, koska kaikki nukleotidit ovat jo pariksi muodostuneet kahden DNA-juosteen välillä. Tahmien päiden etuna on, että fragmentti ihmisen DNA: sta mahtuu bakteeriplasmidiin vain yhteen suuntaan. Sitä vastoin, jos sekä ihmisen DNA: lla että bakteeriplasmidilla on tylpät päät, ihmisen DNA voidaan insertoida päähän tai hännään päähän plasmidiin.
Tahmeajen loppujen sitominen vaatii vähemmän DNA: ta
Vaikka tikkupäällä olevalla DNA: lla on helpompaa löytää toisiaan "tahmeutensa" takia, eivät tahmeat tai tylpät päät voi sulautua yhtenäiseksi DNA-kappaleeksi. Jatkuvan, täysin kytkeytyneen DNA-kappaleen muodostuminen vaatii entsyymiä, jota kutsutaan ligaasiksi. Ligaasit yhdistävät nukleotidien rungot tahmeaan tai tylpään päähän, jolloin tuloksena on jatkuva nukleotidiketju. Koska tahmeat päät löytävät toisensa nopeammin, koska ne ovat kiinnostuneita toisistaan, ligaatioprosessi vaatii vähemmän ihmisen DNA: ta ja vähemmän plasmidi-DNA: ta. DNA: n ja plasmidien tylpät päät eivät todennäköisesti löydä toisiaan, ja siten tylpien päätyjen ligaatio edellyttää, että koeputkeen laitetaan enemmän DNA: ta.
Eri entsyymit voivat antaa saman tahmean pään
Rajoituspaikat sijaitsevat kaikkialla organismien genomissa, mutta ne eivät ole tasaisesti toisistaan. Plasmideissa ne voidaan suunnitella sijoitettaviksi aivan vierekkäin. Tutkijoiden, jotka haluavat leikata fragmentin ihmisen DNA: sta ihmisen genomista, on löydettävä restriktiokohtia, jotka ovat fragmentin alueen edessä ja takana. Sen lisäksi, että varmistetaan, että DNA-fragmentti viedään oikeaan suuntaan, erilaiset tahmeat pääentsyymit voivat luoda saman tahmean pään, vaikka ne tunnistavatkin erilaiset restriktiosekvenssit. Esimerkiksi BamHI: llä, BglII: lla ja Sau3A: lla on erilaiset tunnistussekvenssit, mutta ne tuottavat saman GATC-tahmean pään. Tämä lisää todennäköisyyttä, että kiinnostavia ihmisgeenejäsi reunustavat tahmeat pään restriktiokohdat.
