Tehokkaalla nestekromatografialla (HPLC) työskenneltäessä hyvä kalibrointi on ehdottoman välttämätöntä luotettavien ja laadukkaiden tulosten varmistamiseksi. HPLC-instrumentin asianmukainen kalibrointi alkaa sopivan kalibrointistandardin valmistamisesta. Useimmissa tapauksissa kalibrointi vaatii itse asiassa sarjan standardeja, joiden pitoisuus kasvaa, jotta saadaan ns. Kalibrointikäyrä. Tämä on piirretty viiva ja siihen liittyvä yhtälö, joka kuvaa testattavan kemikaalin konsentraation ja HPLC-detektorin vasteen välistä suhdetta.
Määritä kemikaali, jonka haluat testata HPLC: n avulla ("analyytti"). Voit esimerkiksi testata virvoitusjuomien sarjan fruktoosipitoisuuden suhteen, jolloin fruktoosi olisi analyytti.
Hankitaan sopivan puhtausaste analyyttikemikaalia. Normaalisti puhtauden tulee olla yli 99% ja analyytti tulee ostaa hyvämaineiselta kemiantoimitusyritykseltä. Esimerkiksi fruktoosin tapauksessa ostat puhdasta fruktoosia kemikaalien myyjältä et ruokakaupasta.
Määritä analyytin suurin ja pienin odotettavissa oleva pitoisuus näytteissä, jotka aiot testata HPLC: llä. Virvoitusjuomien osalta voit tutkia juomien etiketit ja määrittää testattavista juomista pienin ja korkein fruktoosipitoisuus. Muista, että alkunäyte (virvoitusjuoma) voidaan laimentaa tai muuten manipuloida analyysivalmistelun aikana (riippuen käytetystä HPLC-menetelmästä), joten analyytin pitoisuus näytteissä, jotka todella injektoidaan HPLC: lle, voi olla muokattu. Huomioon on otettava analyytin pitoisuus näytteissä HPLC-testillä suoritettuna.
Määritä liuotin, johon liuotat analyytin, kalibrointistandardien muodostamiseksi. Tämän liuottimen on kyettävä liuottamaan analyytti asianmukaisesti suhteellisen laajalla pitoisuusalueella (vähintään yhtä korkealle kuin testattavissa olevissa näytteissä). Samoin tämän liuottimen tulisi ideaalisesti olla melko samanlainen kuin "liikkuva faasi": liuotin, jota käytetään näytteiden kuljettamiseen HPLC-instrumentin läpi.
Laske analyytin määrä, joka tarvitaan analyytin "kantastandardiliuoksen" valmistamiseksi. Tämä saadaan kertomalla varastostandardin vaadittu pitoisuus halutulla tilavuudella. Analyytin pitoisuuden tässä liuoksessa on oltava vähintään 10% suurempi kuin suurin odotettu näytepitoisuus. Jos virvoitusjuomanäytteen suurin odotettu fruktoosipitoisuus on 8 grammaa / 100 millilitraa, varastostandardi voitaisiin tehdä pitoisuudeksi 10 grammaa fruktoosia / 100 millilitraa. Kohtuullinen tilavuus on 500 millilitraa, joten tarvitaan 8/100 ml x 500 ml = 40 grammaa fruktoosia.
Punnitaan tarvittava määrä analyytti sopivaan tarkkuustasoon. Usein painoarvo grammoina, tarkasti yhden tai kahden desimaalin tarkkuudella, on sopiva, mutta joillekin menetelmille saattaa olla tarpeen lisätä tarkkuutta.
Siirrä punnittu analyytti tarvittavan tilavuuden mittapulloon ja lisää haluttu liuotin pullon täyttömerkkiin. Mittapullon (esimerkiksi mittalasi mittakaavan sijaan) käyttö lisää varastostandardipitoisuuden tarkkuutta. Varmista, että kaikki analyytti siirretään pulloon. käytä osa liuottimesta sen pesemiseksi tarvittaessa.
Tee sarja vaihtelevaa kantastandardin laimennusta siirtämällä tunnetut varastomäärät tilavuuspulloihin käyttämällä pipettejä tarkkaan siirtoon ja lisäämällä sitten liuotinta. Pienimmän standardipitoisuuden tulisi olla pienempi kuin pienin odotettavissa oleva analysoitava näyte. Virvoitusjuomaesimerkissä, jos pienin odotettu fruktoosipitoisuus näytteessä on 2 grammaa / 100 ml, voidaan tehdä 1 gramman / 100 ml: n standardi. Tämä saavutettaisiin kymmenkertaisella laimennuksella varastostandardista. Standardisarjan tulisi sisältää yhteensä 5 tai 6 konsentraatiota, joten lisälaimennukset standardien tuottamiseksi ehkä 3, 5 ja 8 grammaa fruktoosia / ml vaaditaan. Sinulla on nyt sarja vakioratkaisuja, joilla kalibroidaan HPLC.