Natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) on biokemiallinen menetelmä proteiinien tunnistamiseksi liuoksessa. Kuten Mathews et ai. On havainnollistanut julkaisussa "Biochemistry", proteiininäytteet ladataan ensin "kuoppiin" tai reikiin polyakryyliamidigeelilohkon toisessa päässä. Sitten geeliin kohdistetaan sähkökenttä. Ladattuihin näytteisiin lisätty SDS ei kata proteiinien luonnollista varausta. Tästä syystä proteiinin molekyylipaino yksin määrittää proteiinien migraation nopeuden, kun ne liikkuvat geelin läpi kohti positiivisesti varautunutta napaa, toteaa Bitesize Bio. Useat proteiinit samassa näytteessä eroavat siis toisistaan ja kulkeutuvat eri asemiin.
Suuntaa geelivalokuva. "Yläosa" on niiden kaivojen sijainti, joihin näytteet alun perin lisättiin. "Pohja" on paikka, johon näytteet siirtyivät kohti ja sisältävät useimmiten väriaineen, joka osoittaa näytteiden liikkuvan etuosan. Joko vasemmalla tai oikealla tulisi olla "markkeri", jota käytetään ennustettavana molekyylipainon ohjaimena.
Merkitse näytteet jokaiselle kaistalle. Kaivoon lisätyt näytteet ovat ylhäältäpäin siirtyneet pystysuunnassa "kaistoina". Siksi kaikki pystysarakkeessa näkyvät palkit ovat peräisin yhdestä näytteestä, joka on ladattu suoraan sen yläpuolelle. Käytä viivainta ja kynää rajata kaistat, jos sarakkeiden visualisointi on vaikeaa.
Merkitse nauhojen molekyylikoot merkkikaistalla. Kaupallisesti saatavissa olevilla markkereilla on kuva kaistakuviosta, joka voidaan odottaa yhdessä kunkin kaistan molekyylipainojen kanssa. Nauhat ovat tummia horisontaalisia "tankoja", jotka ovat itse asiassa geeliin upotettua värjätyä proteiinia.
Piirrä vaaleita vaakasuoria viivoja, jotka ulottuvat jokaisesta merkkinauhasta geelin vastakkaiseen reunaan. Ole varovainen, jotta nämä linjat ovat yhdensuuntaiset kaivojen ja väriaineen kanssa. Nämä viivat osoittavat, missä proteiineissa, joiden molekyylipaino on merkitty jokaisella merkkinauhalla, sijaittaisiin jokaisella kaistalla. Esimerkiksi kaistalla 4 oleva kaista, joka sijaitsee juuri viivan alapuolella, ulottuu 25 kilodaltonista merkkinauha viittaa siihen, että kaista 4: n kaista on melkein, mutta ei aivan 25 kilodaltonia molekyylipainossa paino.
Merkitse jokaisen kaistan jokainen kaista sen arvioidulla molekyylipainolla. Käytä merkkejä ohjeena ja arvioi arvot merkkien kokojen välillä.
Tee geelivalokuvan alle luettelo "proteiineista" jokaiselle kaistalle. Aloita ilmoittamalla, mitä jokaisesta näytteestä tiedetään, kuten sen alkuperä tai olosuhteet. Luettele sitten kunkin kaistan arvioitu molekyylipaino. Yhden vyöhykkeen kaistat osoittavat, että näyte sisältää vain yhden proteiinin. Kaistat, joilla on useita kaistoja, osoittavat useiden proteiinien läsnäolon. Nauhat, jotka juoksevat siirtymärintaman kanssa, ovat pienempiä kuin lähimmän markkerin ehdottama, eikä niitä voida todennäköisesti ennustaa, paitsi "pienemmiksi" kuin merkki osoittaa.
Huomaa proteiiniluettelossa omituisuudet. "Tahriintunut" ulkonäkö voi viitata siihen, että läsnä on liian paljon proteiineja tai että näytteen viskositeetti vaikutti sen migraatioon, jos nauhat näyttävät ylittävän kaistan reunalla tai ovat melko suuria muihin nauhoihin verrattuna, niin kyseisen proteiinin pitoisuus on todennäköisesti liian korkea ja se on laimennettava tulevaisuudessa elektroforeesi. Harmahtava sävy koko kaistalla, tummempi kuin taustageelin väri, osoittaa erottamattomia proteiinifragmentteja.
Määritä kunkin kaistan proteiinien identiteetti. Vaikka tämä tehdään käyttämällä vain molekyylipainoa, jokaisen kaistan lähde osoittaa todennäköisesti myös vihjeitä. Harkitse, että joissakin olosuhteissa proteiinit voivat ylläpitää dimeeri- tai trimeeriassosiaatiota geelissä. Siksi yksi proteiini voi esiintyä geelissä kolmena erillisenä vyöhykkeenä. Vaikka proteiineja ei voida tunnistaa, vyöhykkeiden suhteellinen pimeys voi viitata proteiinien pitoisuuksiin liuoksessa. Mikä tahansa utelias ja tuntematon proteiini voidaan eristää suoraan alkuperäisestä geelistä ja lähettää tunnistettavaksi.
Tarvittavat asiat
- Valokuva värjätystä SDS-PAGE-geelistä
- Käytetyn molekyylipainomerkin avain
- Viivotin
- Kynä