Mis on külmumurdumine ja miks on see rakubioloogias kasulik?

Rakumembraanid koosnevad fosfolipiididest ja kinnitatud või kinnistatud valkudest. Membraanvalkudel on raku ainevahetuses ja elus oluline roll. Rakumembraanis adhesioonivalkude, transpordivalkude ja valgukanalite visualiseerimiseks või iseloomustamiseks ei saa kasutada tavalist mikroskoopiat. Kasutades elektronmikroskoopiat ja tehnikat nimega "külmumurd", mis lõhestab külmutatud rakumembraanid, võimaldab visualiseerida membraani struktuuri ja valkude organiseerumist fosfolipiidid. Muude meetodite kombineerimine külmmurdmisega aitab meil mõista mitte ainult rakumembraanide struktuuri ja membraanivalke, kuid võimaldab visualiseerida ja üksikasjalikult analüüsida spetsiifiliste valkude, bakterite ja viirused.

Vedelat lämmastikku kasutades külmutatakse bioloogilised koeproovid või rakud rakkude komponentide immobiliseerimiseks. Rakumembraanid koosnevad kahest kihist fosfolipiididest, mida nimetatakse kahekihiliseks, kus hüdrofoobsed või vett vihkavad lipiidisabad osutavad membraani sisekülg ja lipiidimolekuli hüdrofiilsed või vett armastavad otsad on suunatud väljapoole ja kamber. Külmutatud proov praguneb või purustatakse mikrotoomiga, mis on nuga sarnane instrument õhukeste koelõikude lõikamiseks. See põhjustab rakumembraani jaotumist täpselt kahe kihi vahel, kuna hüdrofoobsete lipiidisabade vaheline külgetõmbejõud esindab kõige nõrgemat kohta. Pärast purustamist läbib proov vaakumprotseduuri, mida nimetatakse külmutatud söövitamiseks. Murdunud pind proov varjutatakse süsiniku ja plaatina auruga, et saada stabiilne koopia, mis järgib murru kontuure lennuk. Hapet kasutatakse koopia külge kleepunud orgaanilise materjali seedimiseks, jättes murdunud membraanipinnast õhukese plaatinakesta. Seejärel analüüsitakse seda kest elektronmikroskoopia abil.

Külmutatud söövitamine on fikseerimata, külmutatud ja külmumurdunud bioloogilise proovi vaakumkuivatamine. Vaakumkuivatus on sarnane puu- ja köögiviljade külmkuivatamisega, mis on pakendatud ja mida müüakse toidupoodides. Ilma külmutatud söövitamiseta varjavad jääkristallid paljusid raku struktuuri üksikasju. Sügav- või külm-söövitusetapp parandab ja laiendab algset külmumurrumenetlust, võimaldades rakumembraane jälgida erinevate tegevuste ajal. See võimaldab analüüsida mitte ainult membraani struktuuri, vaid ka rakusiseseid komponente ning annab üksikasjalikku struktuuriteavet bakterite, viiruste ja suurte rakuvalkude kohta kompleksid.

Elektronmikroskoopia abil saab avastada ja suurendada rohkem kui miljon korda väiksemaid organisme või struktuure, nagu bakterid, viirused, rakusisesed komponendid ja isegi valgud. Visualiseerimine toimub ultrapeenikese proovi pommitamisega elektronkiirega. Kaks elektronmikroskoopia meetodit on skaneeriv elektronmikroskoopia ehk SEM ja ülekandelektronmikroskoopia ehk TEM. Külmumurdude proove analüüsitakse rutiinselt TEM-iga. TEM on parema eraldusvõimega kui SEM ja pakub struktuuriteavet kuni 3 nanomeetri koopiateni.

Külmumurru elektronmikroskoopia väljatöötamine ja kasutamine näitas, et rakuplasma membraanid koosnevad lipiidide kahekihilistest materjalidest ja selgitasid, kuidas valgud on rakumembraanides organiseeritud. Külmumurd annab ainulaadse välimuse rakumembraanide sisemusse, kuna see jagab ja eraldab membraani fosfolipiidid kaheks vastandlikuks ja üksteist täiendavaks leheks või tahuks. Enam kui 50 aasta jooksul pärast esimese külmutatud murru masina kasutuselevõttu on plaatina koopia tegemine ainus viis rakumembraani kohta struktuurilise teabe saamiseks. Tehnika näitab, kas spetsiifilised valgud hõljuvad või on rakumembraanis ankurdatud ning kas ja kuidas mõned valgud agregeeruvad. Uuem meetod - spetsiifilistele valkudele suunatud antikehade kasutamine - kombineeritakse külmumurruga, et tuvastada valgud ja nende funktsioon rakumembraanis.