On võimalik kloonida terveid organisme, näiteks lammast Dolly, kuid DNA kloonimine on erinev. Selle valmistamiseks kasutatakse molekulaarbioloogia tehnikaid DNA järjestuste või üksikute geenide identsed koopiad.
Geenitehnoloogia meetodite abil tuvastatakse ja eraldatakse DNA geneetilise koodi segmendid. Seejärel kopeerib DNA kloonimine nukleiinhape järjestused segmentides.
Saadud identseid koopiaid saab kasutada edasiseks uurimiseks või biotehnoloogia rakendamiseks. Sageli kodeerib kopeeritav geen valku, mis võib olla osa meditsiinilisest ravist. DNA tehnoloogia, sealhulgas DNA kloonimine toetab arusaama sellest, kuidas geenid töötavad ja kuidas inimese geneetiline kood mõjutab keha toimimist.
DNA kloonimine: määratlus ja protsessi ülevaade
DNA kloonimine on molekulaarbioloogia protsess, mille abil tehakse kromosoomides paiknevate arenenud organismide geneetilist koodi sisaldavate DNA segmentide identsed koopiad.
Protsess tekitab suurtes kogustes sihtmärk-DNA järjestused. DNA kloonimise eesmärk on toota ise sihtmärk-DNA järjestusi või toota sihtjärjestustes kodeeritud valke.
Nimetatakse kahte DNA kloonimisel kasutatud meetodit plasmiidvektor ja polümeraasi ahelreaktsioon (PCR). Aastal plasmiidvektor meetodil lõigatakse DNA ahelad kasutades restriktsiooniensüümid DNA fragmentide tootmiseks ja saadud segmendid sisestatakse edasiseks dubleerimiseks kloonimisvektoritesse, mida nimetatakse plasmiidideks. Plasmiidid paigutatakse bakterirakkudesse, mis toodavad seejärel DNA koopiaid või kodeeritud valke.
Aastal PCR meetod, on dubleeritavate DNA ahelate segment tähistatud ensüümidega, mida nimetatakse aabitsad. Polümeraasi ensüüm teeb koopiad DNA ahela märgitud osast. See meetod ei kasuta restriktsiooniensüüme ja võib väikestest proovidest toota kloonitud DNA-d. Mõnikord kasutatakse kahte DNA-tehnoloogia meetodit koos, et kaasata üldisesse reaktsiooni mõlema parimad omadused.
Plasmiidvektori meetod
Meetodi vektor viitab plasmiidile, mida kasutatakse kloonitava DNA sihtmärgi segmendi hoidmiseks. Plasmiidid on väikesed ümmargused kiud mitte-kromosomaalne DNA leidub paljudes organismides, sealhulgas bakterites ja viirustes.
Bakteriaalsed plasmiidid on vektor, mida kasutatakse DNA sihtmärgisegmendi sisestamiseks bakterirakkudesse edasiseks dubleerimiseks.
DNA sihtmärgi valimine ja eraldamine: Enne DNA kloonimisprotsessi alustamist tuleb tuvastada DNA järjestused, eriti DNA segmentide algus ja otsad.
Selliseid DNA järjestusi võib leida olemasolevate kloonitud DNA-d kasutades teadaolevate järjestustega või uurides DNA sihtjärjestuse toodetud valku. Kui järjestus on teada, saab kasutada vastavaid restriktsiooniensüüme.
Siht-DNA lõikamine restriktsiooniensüümidega: DNA-koodi otsimiseks sihtjärjestuste alguses ja lõpus valitakse piiravad ensüümid.
Kui restriktsiooniensüümid leiavad aluspaaride spetsiaalse kodeeritud järjestuse, mida nimetatakse restriktsioonisaitideks, siis need kinnitada end selles asukohas oleva DNA külge ja kerida end ümber DNA molekuli, katkestades haru. Lõppenud DNA segmendid, mis sisaldavad sihtjärjestust, on nüüd dubleerimiseks saadaval.
Plasmiidvektori valimine ja märklaud-DNA sisestamine: Sobiv plasmiid sisaldab ideaalis samu DNA kodeerivaid järjestusi kui see DNA ahel, millest siht-DNA lõigati. Plasmiidi ümmargune DNA ahel lõigatakse samade restriktsiooniensüümidega, mida kasutati märklaud-DNA lõikamiseks.
A DNA ligaasi ensüüm kasutatakse DNA segmendi sidumise edendamiseks ja sihtmärgi DNA segmendi otsad ühenduvad plasmiidse DNA lõigatud otstega. Siht-DNA moodustab nüüd osa ümmarguse plasmiidi DNA ahelast.
Plasmiidi sisestamine bakterirakku: Kui plasmiid sisaldab kloonitavat DNA järjestust, võib tegelik kloonimine toimuda nn protsessi abil bakterite transformatsioon. Plasmiidid sisestatakse bakterirakku nagu E. coli ja uute DNA segmentidega rakud hakkavad tootma koopiaid ja vastavaid valke.
Bakterite transformeerimisel inkubeeritakse peremeesrakke ja plasmiide koos kehatemperatuuril umbes 12 tundi. Rakud neelavad osa plasmiididest ja käsitlevad neid oma plasmiidi DNA-na.
Kloonitud DNA ja valkude kogumine: Enamikul DNA kloonimiseks kasutatud plasmiididest on antibiootikumiresistentsuse geenid nende DNA-sse. Kui bakterirakud neelavad uusi plasmiide, muutuvad nad antibiootikumide suhtes resistentseks.
Kui kultuuri töödeldakse antibiootikumidega, jäävad ellu ainult need rakud, mis on uusi plasmiide imendunud. Tulemuseks on kloonitud DNA-ga puhas bakterirakkude kultuur. Seejärel saab DNA koguda või toota vastavat valku.
PCR (polümeraasi ahelreaktsioon) meetod
The PCR meetod on lihtsam ja kopeerib olemasoleva DNA oma kohale. See ei nõua restriktsiooniensüümidega lõikamist ega sisestamist plasmiidDNA järjestused. See muudab selle eriti sobivaks DNA proovide kloonimiseks piiratud arvu DNA ahelatega. Kuigi meetod võib DNA kloonida, ei saa seda kasutada vastava valgu tootmiseks.
DNA ahelate lahti keeramine: Kromosoomides sisalduv DNA on tihedalt keerdunud topeltheeliksi struktuuris. DNA kuumutamine temperatuurini 96 kraadi Celsiuse järgi denatureerimine paneb DNA molekuli kerima ja eralduma kaheks ahelaks. See eraldamine on vajalik, kuna korraga saab kloonida ainult ühte DNA ahelat.
Praimerite valimine: Nagu plasmiidvektori DNA kloonimisel, tuleb ka kloonitavad DNA järjestused identifitseerida, pöörates erilist tähelepanu DNA segmentide algustele ja otstele. Praimerid on ensüümid, mis kinnituvad spetsiifilistele DNA koodijärjestustele ja need tuleb valida DNA sihtmärkide segmentide tähistamiseks. Õiged praimerid kinnituvad DNA molekuli järjestuste külge, märkimaks sihtsegmentide algust ja otsa.
Praimerite sidumise reaktsiooni lõõmutamine: Nimetatakse reaktsiooni jahutamine umbes 55 kraadini lõõmutamine. Kui reaktsioon jahtub, aktiveeritakse praimerid ja kinnituvad end DNA sihtmärgi segmendi mõlemas otsas oleva DNA ahela külge. Praimerid toimivad ainult markeritena ja DNA ahelat ei pea lõikama.
DNA sihtmärgisegmendi identsete koopiate tootmine: Nimetatud protsessis pikendamine, lisatakse reaktsioonile soojustundlik TAQ polümeraasi ensüüm. Seejärel kuumutatakse reaktsioon ensüümi aktiveerimiseni temperatuurini 72 ° C. Aktiivne DNA polümeraasi ensüüm seondub praimeritega ja kopeerib nende vahel DNA järjestuse. Esialgne DNA järjestamine ja kloonimine on lõppenud.
Kloonitud DNA saagise suurendamine: Esmane lõõmutamis- ja pikendamisprotsess loob suhteliselt vähe olemasolevate DNA-ahelate segmentide koopiaid. Saagise suurendamiseks täiendava DNA replikatsiooni kaudu jahutatakse reaktsioon uuesti praimerite taasaktiveerimiseks ja nende seondumiseks teiste DNA ahelatega.
Seejärel aktiveerib reaktsiooni uuesti kuumutamine polümeraasi ensüümi ja tekib rohkem koopiaid. Seda tsüklit saab korrata 25–30 korda.
Plasmiidvektori ja PCR DNA kloonimismeetodite kasutamine koos
Plasmiidvektorimeetod tugineb DNA esialgsele piisavale tarnimisele plasmiidide lõikamiseks ja sisestamiseks. Liiga vähe algset DNA-d põhjustab vähem plasmiide ja kloonitud DNA tootmise algust aeglaselt.
PCR-meetod võib toota suures koguses DNA-d vähestest algsetest DNA-ahelatest, kuid kuna DNA-d ei implanteerita bakterirakku, pole valgu tootmine võimalik.
Väikesest esialgsest DNA proovist kloonitavate DNA fragmentides kodeeritud valgu tootmiseks saab neid kahte meetodit kasutada koos ja neid saab täiendavad üksteist. Kõigepealt kasutatakse PCR-meetodit DNA kloonimiseks väikesest proovist ja paljude koopiate tootmiseks.
Seejärel kasutatakse PCR-tooteid plasmiidvektorimeetodiga, et implanteerida toodetud DNA soovitud valku tootvatesse bakterirakkudesse.
DNA kloonimise näited biotehnoloogia jaoks
Molekulaarbioloogia kasutab geenide kloonimist ja DNA replikatsiooni meditsiinilistel ja kaubanduslikel eesmärkidel. Kloonitud DNA järjestustega baktereid kasutatakse ravimite tootmiseks ja ainete asendamiseks, mida geneetiliste häiretega inimesed ise ei suuda toota.
Tüüpilised kasutusalad on:
- Geen iniminsuliin kloonitakse bakteritesse, mis toodavad seejärel diabeetikute kasutatavat insuliini.
- Kudede plasminogeeni aktivaator toodetakse kloonitud DNA-st ja seda kasutatakse abiks vältida verehüübeid.
- Inimese kasvuhormoon saab toota ja manustada inimestele, kes ise ei saa seda toota.
Biotehnoloogia kasutab geenikloonimist põllumajanduses ka taimedele ja loomadele uute omaduste loomiseks või olemasolevate omaduste parandamiseks. Kui kloonitakse rohkem geene, suureneb võimalike kasutuste arv hüppeliselt.
DNA kloonimise näited uurimistööks
DNA molekulid moodustavad elusas rakus väikese osa materjalist ja paljude geenide mõjusid on raske isoleerida. DNA kloonimismeetodid annavad uurimiseks suures koguses spetsiifilist DNA järjestust ja DNA toodab valke täpselt nii, nagu algses rakus. DNA kloonimine võimaldab seda toimingut eraldi uurida erinevate geenide jaoks.
Tüüpilised uuringud ja DNA-tehnoloogia rakendused hõlmavad järgmist:
- Geeni funktsioon.
- Geeni mutatsioonid.
- Geeniekspressioon.
- Geenitooted.
- Geneetilised defektid.
Kui kloonitakse rohkem DNA järjestusi, on täiendavate järjestuste leidmine ja kloonimine lihtsam. Olemasolevate kloonitud DNA segmentide abil saab kindlaks teha, kas uus segment sobib vanaga ja millised osad on erinevad. Seejärel on sihtmärk-DNA järjestuse tuvastamine kiirem ja täpsem.
DNA kloonimise näited geeniteraapia jaoks
Sisse geeniteraapia, esitatakse kloonitud geen organismi rakkudele, mille looduslik geen on kahjustatud. Elutähtsat geeni, mis toodab organismi spetsiifiliseks toimimiseks vajalikku valku, võib muteerida, kiirgusega muuta või viirused mõjutada.
Kui geen ei tööta korralikult, puudub rakust oluline aine. Geeniteraapia üritab asendage geen kloonitud versiooniga, mis toodab vajalikku ainet.
Geeniteraapia on endiselt eksperimentaalne ja tehnikat kasutades on ravitud väheseid patsiente. Probleemid seisnevad ühe haigusseisundi eest vastutava ühe geeni väljaselgitamises ja paljude geeni koopiate toimetamises õigetesse rakkudesse. Kuna DNA kloonimine on laiemalt levinud, on geeniteraapiat rakendatud mitmes konkreetses olukorras.
Viimaste edukate rakenduste hulka kuuluvad:
- Parkinsoni tõbi: Kasutades vektorina viirust, süstiti patsientide keskajudesse Parkinsoni tõvega seotud geen. Patsiendid kogesid motoorseid oskusi ilma kõrvaltoimete kõrval.
- Adenosiindeaminaasi (ADA) defitsiit: Geneetilist immuunhäiret raviti patsientide vere tüvirakkude eemaldamisega ja ADA geeni sisestamisega. Selle tulemusena suutsid patsiendid toota vähemalt mõnda oma ADA-d.
- Hemofiilia: Hemofiiliaga inimesed ei tooda spetsiifilisi valke, mis aitavad vere hüübimist. Patsientide maksarakkudesse sisestati geen ühe puuduva valgu tootmiseks. Patsiendid tootsid valku ja verejooksude arv vähenes.
Geeniteraapia on üks DNA kloonimise kõige lootustandvamaid rakendusi, kuid tõenäoliselt uuritakse ka muid uusi kasutusviise, kuna uuritakse rohkem DNA järjestusi ja määratakse nende funktsioon. DNA kloonimine annab geenitehnoloogia tooraine vajalikus koguses.
Kui geenide roll on teada ja nende nõuetekohase toimimise saab tagada defektsete asendamisega geene, paljusid kroonilisi haigusi ja isegi vähki saab DNA abil rünnata ja ravida geneetiliselt tehnoloogia.
Seotud sisu:
- E.Coli (Escherichia Coli) kolooniaomadused
- RNA: määratlus, funktsioon, struktuur