Molekulaarne kloonimine on levinud biotehnoloogia meetod, mida peaks tundma iga õpilane ja teadlane. Molekulaarne kloonimine, kasutades teatud tüüpi ensüümi, mida nimetatakse restriktsiooniensüümiks, et lõigata inimese DNA fragmentideks, mida saab seejärel sisestada bakteriraku plasmiidi DNA-sse. Piiravad ensüümid lõikavad kaheahelalise DNA pooleks. Sõltuvalt restriktsiooniensüümist võib lõikamine põhjustada kas kleepuva või nüri otsa. Kleepuvad otsad on molekulaarkloonimisel kasulikumad, kuna need tagavad inimese DNA fragmendi sisestamise plasmiidi õiges suunas. Ligeerimisprotsess ehk DNA fragmentide sulandamine nõuab vähem DNA-d, kui DNA-l on otsad kleepuvad. Lõpuks võivad mitu kleepuva otsa restriktsiooni ensüümi toota sama kleepuva otsa, kuigi iga ensüüm tunneb ära erineva restriktsioonjärjestuse. See suurendab tõenäosust, et kleepuvate lõpuensüümide abil saab teie huvipakkuva DNA piirkonna välja lõigata.
Piirangute ensüümid ja piirangute saidid
Piiravad ensüümid on ensüümid, mis lõikavad ära kaheahelalise DNA spetsiifilised järjestused ja lõikavad DNA selles järjestuses pooleks. Tunnustatud järjestust nimetatakse restriktsioonikohaks. Piiravaid ensüüme nimetatakse endonukleaasideks, kuna need lõikavad DNA ahelate vahelistes kohtades kaheahelalist DNA-d, nii nagu DNA tavaliselt eksisteerib. Seal on rohkem kui 90 erinevat restriktsiooniensüümi. Igaüks tunneb ära eraldi piirangukoha. Piiravad ensüümid lõhustavad oma vastavad restriktsioonisaidid 5000 korda tõhusamalt kui teised saidid, mida nad ei tunne.
Õige suund
Piiravad ensüümid kuuluvad kahte üldklassi. Nad kas lõikavad DNA kleepuvateks või nürideks otsteks. Kleepuval otsal on lühike nukleotiidide piirkond, DNA ehitusplokid, mis on paaristamata. Seda paarimata piirkonda nimetatakse üleulatuvaks osaks. Ülekandmine on väidetavalt kleepuv, kuna see tahab ja sobitub teise kleepuva otsaga, millel on komplementaarne üleulatuv järjestus. Kleepuvad otsad on nagu ammu kadunud kaksikud, kes püüavad kohtumisel üksteist tugevalt kallistada. Teisalt ei ole nürid otsad kleepuvad, kuna kõik nukleotiidid on DNA kahe ahela vahel juba paaris. Kleepuvate otste eeliseks on see, et inimese DNA fragment mahub bakteriplasmiidi ainult ühes suunas. Seevastu, kui nii inimese DNA-l kui ka bakteriaalsel plasmiidil on nürid otsad, võib inimese DNA sisestada plasmiidi pea-saba või saba-pea külge.
Kleepuvate otsade sidumine nõuab vähem DNA-d
Kuigi pulgaotstega DNA-l on oma „kleepuvuse” tõttu lihtsam üksteist leida, ei saa ei kleepuvad ega nürid otsad sulanduda pidevaks DNA-tükiks. Täielikult seotud DNA katkematu tüki moodustamiseks on vaja ensüümi, mida nimetatakse ligaasiks. Ligaasid ühendavad kleepuvas või nüri otsas nukleotiidide selgroogasid, mille tulemuseks on pidev nukleotiidide ahel. Kuna kleepuvad otsad leiavad üksteise ligimeelitamise tõttu kiiremini, nõuab ligeerimisprotsess vähem inimese DNA-d ja vähem plasmiidi DNA-d. DNA ja plasmiidide nürid otsad on vähem tõenäolised, et üksteist leida ja seega nõuab nüri otste ligeerimine katseklaasi rohkem DNA sisestamist.
Erinevad ensüümid võivad anda sama kleepuva lõpu
Piirangukohad asuvad kogu organismide genoomis, kuid ei asu ühtlaselt. Plasmiidides saab neid konstrueerida nii, et need asetseksid üksteise kõrval. Teadlased, kes soovivad inimese genoomist inimese DNA fragmendi välja lõigata, peavad leidma restriktsioonikohad, mis asuvad fragmendi piirkonna ees ja taga. Lisaks sellele, et tagatakse DNA fragmendi õiges suunas sisestamine, võivad erinevad kleepuva otsa ensüümid luua sama kleepuva otsa, kuigi nad tunnevad ära erinevad restriktsioonijärjestused. Näiteks BamHI, BglII ja Sau3A on erinevad äratundmisjärjestused, kuid toodavad sama GATC kleepuvat otsa. See suurendab tõenäosust, et leidub kleepuvaid otsapiirangu saite, mis külgnevad teie huvipakkuva inimese geeniga.