Kuidas kujundada PCR-praimerit

Wisconsini ülikooli BioWebi veebisaidi andmetel on PCR-praimer lühike, sünteetiline oligonukleotiid (tavaliselt vahemikus 18 kuni 25 alust pikk), mida kasutatakse DNA spetsiifiliste piirkondade amplifitseerimiseks molekulaarbioloogia tehnikas, mida nimetatakse polümeraasi ahelreaktsiooniks (PCR). Vaja on nii edasi- kui ka tagasikäigu praimerit, mis on kavandatud DNA ahela pöördkomponentideks, külgnema ja seonduma soovitud DNA piirkonnaga. Kui teadlased soovivad uurida konkreetset geeni või DNA piirkonda, peavad nad kõigepealt tegema PCR, et omandada piisavalt sihtpiirkonda, millega töötada. Huvipakkuvale piirkonnale võib vajalikuks osutuda praimerjärjestuste kujundamine, kui need pole varem avaldatud uuringute või kommertsmeetodite abil juba saadaval.

Hankige huvipakkuva geeni või DNA piirkonna nukleotiidjärjestus ja otsustage, kui kaua fragmenti soovite amplifitseerida. Edasine ja tagurpidi praimer on kavandatud seonduma soovitud fragmendi alguses ja lõpus. Tavaliselt kasutatakse tavapärastes PCR-meetodites praimereid, mis külgnevad vahemikus 100 kuni 1000 aluspaari, samas kui reaalajas PCR-meetodid kasutavad umbes 50 kuni 200 aluspaari pikkuseid fragmente.

instagram story viewer

Otsustage, kus järjestuses soovite, et praimerid valetaksid. Näiteks võite soovida asukohta järjestuse 5 'või 3' otsa lähedal või keskel. Soovi korral määrake praimerite asukoht, et see ulatuks introni.

Kujundage krundid pikkusega 18 kuni 24 alust. Vincent R. Brinkmann Instruments Inc.-st pärit Ph.D. Prezioso soovitab, et see pikkus oleks piisavalt pikk, et olla soovitud DNA piirkonnale äärmiselt spetsiifiline, kuid piisavalt lühike, et hõlpsasti seonduda (anniilida). Praimeri sulamistemperatuur (Tm) peaks olema vahemikus 55 kuni 80 kraadi Celsiuse järgi, piisavalt madal, et võimaldada täielikku sulamist temperatuuril 90 kraadi või üle selle, kuid piisavalt kõrge, et võimaldada lõõmutamist. GC sisaldus (Gs ja Cs protsent järjestuses) peaks jääma vahemikku 40–60 protsenti. Praimeri järjestuse 3'-ots peaks seondumise edendamiseks lõppema C või G-ga (nn GC-klamber), kuna G ja C nukleotiididel on tugevamad sidemed, kuid välditakse järjestuse viies viimases aluses kolme või enama G või Cs olemasolu.

Vältige nelja või enama aluse (nt ACCCC ...) või nelja või enama dinukleotiidikorduse (nagu ATATATAT ...) kasutamist, kuna need võivad põhjustada valeprintimist. Kujundage aabitsad, millel pole aabitsasisest homoloogiat (rohkem kui kolm alust, mis täiendavad ühte praimer ise) või praimeritevaheline homoloogia (kus edasi- ja tagurpidi praimeril on komplementaarne järjestused). See võib põhjustada isedimeere või praimerdimeere, kus praimerid seonduvad soovitud DNA järjestusega iseendaga.

Kasutage võrguressursse ja veebisaite, mis aitavad krundi kujundamisel või aitavad kontrollida kruntide järjestusi, kas need täiendavad ennast või on võimalik luua teiseseid struktuure nagu juuksenõelad. Mõned aabitsakujunduse veebisaidid hõlmavad Massachusettsi Tehnoloogiainstituudi Primer3, Riikliku Biotehnoloogia Teabekeskuse Primer-Blast ja Integreeritud DNA-tehnoloogiate OligoAnalyzer.

Teachs.ru
  • Jaga
instagram viewer