Tris ehk tris (hüdroksümetüül) aminometaan on tavaline bioloogiline puhver, mida kasutatakse kogu DNA ekstraheerimisprotsessi vältel. Igast mitmest allikast ekstraheerimise ajal on DNA pH-tundlik. Rakkude lagunemise, soovimatute rakukomponentide eemaldamise ja sadestamise ajal kasutatakse tris stabiilse pH säilitamiseks. Lisaks mängib see rakkude lüüsimisel eriti olulist rolli.
TL; DR (liiga pikk; Ei lugenud)
DNA ekstraheerimine on pH-tundlik protsess ja tris-puhvri kasutamine aitab hoida pH stabiilsena rakkude lagunemise ja ekstraheerimise ajal.
Tris puhvrina
Kuna pH-d võivad mõjutada ja mõjutada mitmed rakulised tegurid, on stabiilse pH säilitamine eksperimentaalse teaduse jaoks hädavajalik. Bioloogilised puhvrid, nagu tris, on olulised, kuna need suudavad säilitada stabiilse pH vaatamata mõjudele, mis muidu võivad pH-d muuta. Tris (hüdroksümetüül) aminometaan pKa väärtusega 8,1 on efektiivne puhver vahemikus pH 7 kuni 9. Neutraalse vahemiku tõttu on tris bioloogilistes laborites tavaliselt kasutatav puhver. Tris-puhver on siiski temperatuuritundlik ja ebatäpsuse vältimiseks tuleks seda kasutada temperatuuril, millel see algselt pH-tasemele lisati.
Rakkude lüüs
Lüüs ehk rakkude avamine on DNA ekstraheerimise esimene etapp. See saavutatakse puhvriga, mis sisaldab tris ja EDTA-d (etüleendiamiintetraäädikhape). EDTA seob kahevalentsed katioonid nagu kaltsium ja magneesium. Kuna need ioonid aitavad säilitada rakumembraani terviklikkust, destabiliseerib nende eemaldamine EDTA-ga membraani. Tris on peamine puhverduskomponent; selle peamine ülesanne on hoida puhvri pH stabiilses punktis, tavaliselt 8,0. Lisaks tris tõenäoliselt interakteerub membraanis oleva LPS-ga (lipopolüsahhariid), mis aitab membraani destabiliseerida edasi.
Tris kaitseb DNA-d pH muutuste eest
Kui rakud on lahutatud, valatakse nende DNA ja sisu puhvrisse. Lisaks lisatakse sageli RNaas A (hävitab RNA), proteaasid (hävitab valke) ja SDS (naatriumdodetsüülsulfaat, solubiliseerib membraanifragmente). Kokkuvõttes võib see rakusisaldusega supp ja killustatud RNA ning valgud mõjutada oluliselt lahuse pH-d. Kuna DNA on pH-tundlik, on trissi jaoks oluline suppi puhverdada ja hoida pH stabiilses punktis.
DNA sade
DNA ekstraheerimise viimases etapis ekstraheeritakse lahusest DNA ise. Sel hetkel lahustub DNA puhvris. Lahusest ekstraheerimiseks muudetakse DNA etanooli või isopropanooli (isopropüülalkohol) lisamisel lahustumatuks. Kui see on tehtud, ilmneb DNA lahuses valge tahkemisena. Ehkki ülejäänud rakukomponentidest võib sel viisil eraldada DNA, pole see lahustuvana "kasutatav". Pärast eraldamist alkohol eemaldatakse ja DNA tuleb tagasi viia bioloogilisse puhvrisse, nagu näiteks tris.
Tee seda ise
Kuigi DNA ekstraheeritakse tavaliselt uurimislaborites, kasutades tavaliselt ühte paljudest kaubanduslikult saadaval olevad komplektid, igaüks saab kodus DNA-d eraldada, kasutades tavalisi majapidamistarbeid ja rohelist herned või spinat. Sel juhul ei sisalda tris ega ühtegi bioloogilist puhvrit, et kaitsta DNA-d pH muutuste eest. Kuid see on visuaalne viis, kuidas aidata õpilastel rakulise DNA-ga ühendust saada.