Kuidas DNA proov võetakse ja uurimiseks ette valmistatakse

Enne kui nad suudavad DNA järjestada või geenitehnoloogia abil muuta, peavad teadlased selle kõigepealt isoleerima. See võib tunduda keeruline ülesanne, kuna rakud sisaldavad paljusid muid ühendeid, nagu valgud, rasvad, suhkrud ja väikesed molekulid. Õnneks saavad bioloogid kasutada DNA keemilisi omadusi, et eraldada DNA nendest saasteainetest ja valmistada see ette edasiseks uurimiseks. Seda protsessi nimetatakse DNA ekstraheerimiseks.

DNA ekstraheerimiseks kasutatakse palju erinevaid tehnikaid. Individuaalse labori kasutatav katse sõltub läbiviidava katse tüübist ja sellest, kui puhas DNA peab olema. Teadlased alustavad tavaliselt rakke sisaldavast proovist - näiteks koe- või vereproovist - ja lõhustavad rakud või lüüsivad need. Rakkude lüüsimiseks on mitmeid viise. Pesuvahendi lisamine põhjustab nende eraldumist, nagu ka allutamine kõrgsageduslikele helilainetele. Teise võimalusena segab proovi klaashelmestega segamine ja kiire vibreerimine rakud füüsiliselt laiali ja vabastab nende sisu.

Kui suurt puhtust pole vaja, võivad teadlased suurema osa proovis sisalduvate valkude lagundamiseks lisada ensüümi nimega proteinaas K ja kasutada seda sellisena nagu see on. See tehnika on aga väga räpane, kuna enamik saasteaineid on endiselt olemas, seega sobib see ainult siis, kui kiirus on esmatähtis ja puhtus pole küsimus. Teine kiire ja määrdunud lähenemisviis on valkude eemaldamine, suurendades soolade kontsentratsiooni, lisades sooli nagu ammoonium või kaaliumatsetaat, et sundida valke sadestuma. Ka see tehnika on üsna räpane, kuna paljud muud saasteained on endiselt olemas.

Teine lähenemisviis on rakkude lüüsimine detergendiga, seejärel lahuse segamine isoamüülalkoholi, kloroformi ja fenooliga. Seejärel lahus jaguneb kaheks kihiks. Valgud satuvad ülemisse orgaanilisse kihti, samas kui DNA jääb alumisse vesikihti. See tehnika nõuab heade tulemuste saamiseks soola kontsentratsiooni ja pH hoolikat kontrollimist. See on aeganõudev ning nii fenool kui ka kloroform on väga mürgised kemikaalid. Järelikult, kui fenooli ja kloroformi ekstraheerimine oli kunagi rutiinne, on muud meetodid viimastel aastatel populaarsemad.

Anioonvahetuskromatograafia pakub kõrgemat puhtust ja ühtlasemaid tulemusi kui ekstraheerimine fenool-kloroformiga. Toru või kolonn on täis väikesi osakesi, millel on positiivselt laetud kohad, kuhu negatiivselt laetud molekul või anioon võivad seonduda. DNA seondub nende anioonivahetuskohtadega, samal ajal kui muud saasteained, nagu valgud ja RNA, pestakse kolonnilt. Hiljem kasutatakse DNA kolonnist eemaldamiseks soolarikast lahust.

Kiireim ja võib-olla usaldusväärsem tehnika DNA puhastamiseks on spetsiaalselt valmistatud komplekti kasutamine. Need komplektid sisaldavad torus silikageeli membraane. DNA kleepub membraanile, samal ajal kui teised saasteained pestakse komplekti kuuluvate spetsiaalselt valmistatud soolalahuste sarja abil. Lõpuks pestakse DNA kolonnilt madala soolasisaldusega lahusega. Need komplektid on kiired, hõlpsasti kasutatavad ja pakuvad reprodutseeritavaid tulemusi.

Kui DNA on eraldatud ja pH-ga kontrollitud puhverlahuses uuesti suspendeeritud, on viimane samm selle puhtuse testimine. Lihtne ja mugav viis seda teha on kontrollida, kui palju ultraviolettvalgust see neelab lainepikkustel 260 ja 280. Neeldumine 260 nanomeetril jagatuna neeldumisega 280 nanomeetril peaks olema võrdne 1,8, kui DNA on puhas. Absorbtsiooni mõõtmine 260 nanomeetril võimaldab teil määrata ka DNA kontsentratsiooni.