Üks klassikaline viis mikroobide kontsentratsiooni määramiseks proovis on proovi lahjendamine, mikroobide kasvatamine plaatidel ja kolooniate loendamine. Plaaditud mikroobid kasvavad ühest või mitmest rakust koosnevast kolooniat moodustavast üksusest nähtavaks kolooniaks, mida saab näha ja loendada. Bakterid on levinuim mikroob, mida plaatide arvu abil hinnata. Kolooniate loendamist kasutatakse mikroobide tuvastamiseks ja loendamiseks mullas, vees ja toidus. Kolooniate loendamise protokollid rõhutavad täpset ja metoodilist lähenemist.
Proovide lahjendamine, plaadistamine ja inkubeerimine
Kui määrite mikroobiproovi lihtsalt agarplaadile, näete nii palju kolooniaid moodustavaid üksusi, et üksikud kolooniad sulanduvad kokku, mis muudab nende loendamise võimatuks. Selle probleemi lahendamiseks segage proov vedelasse keskkonda, võtke väike kogus seda segu ja lahjendage seda veelgi. Korrake seda protsessi kuus kuni kümme korda. Jaotage viimane lahjendus agarplaadile ja inkubeerige seda neli kuni seitse päeva enne kolooniate loendamist.
Käsitsi loendamine
Kolooniate loendamise peamine nipp on iga kolooniapunkti loendamine üks kord. Üks lähenemisviis on seada Petri tass võre taustale ja lugeda igas võrgurakus olevad kolooniad, liikudes metoodilise mustri järgi läbi kõigi rakkude. Abiks võib olla ka loendatud kolooniate märkimine Petri tassi tagaküljele. Üldiselt peate loendama vähemalt kolm plaati; usaldusväärsete järelduste tegemiseks kasutage ainult plaate, mis sisaldavad 30 kuni 300 kolooniat, soovitab laboritele ja tootjatele konsultatsiooniteenuseid pakkuv ettevõte Microbiology Network. Plaadid, mille kolooniad on loendamiseks liiga arvukad või liiga vähe, tuleb uuest lahjendusest uuesti plaadistada.
Automaatne loendamine
Inimlikud eksimused lisavad aega, mis kulub kolooniate käsitsi lugemisele. Nii täpsuse kui ka tõhususe parandamiseks asetage Petri tass kolooniate automatiseeritud loendusseadmesse. Automaatsed koloonialoendurid teevad roogist pildi, eraldavad kolooniad taustast ja kasutavad seejärel algoritmi abil plaatide kolooniad. Algoritmidel võib olla raskusi kolooniate eristamisega, kui kaks või enam kolooniat puudutavad servi, nii et see on pideva tarkvaraarenduse valdkond.
Lugemise keerukamaks muutmine
Kolooniate arvu põhjal mikroobide tiheduse arvutamise täpsusel on mõned piirangud. Kolooniaid moodustavad üksused võivad olla üks rakk, rakkude ahel või terve rakuhulk. Eeldatakse, et koloonia esindab ühte rakku, seega võib kolooniate arvu järgi arvutatud kontsentratsioon olla madal. Erinevad mikroobid vajavad erinevaid kasvutingimusi ja plaadil olevad kolooniad esindavad ainult neid mikroobe, mis selles inkubatsioonitingimustes selles kasvukeskkonnas arenevad. Lisaks ei registreeri kolooniate loendamine surnud rakke, mis on oluline kaalutlus juhul, kui vajate rakkude kontsentratsiooni algses proovis.